Se estudiaron 24 ratas Sprague-Dawley macho con un peso medio (± error estándar) de 306±30g, en un modelo experimental de obstrucción de la vía aérea por medio de ligadura traqueal de 7 días de evolución. Los animales se aleatorizaron en 4 grupos: a) grupo control, sin OT (n=6); b) grupo con OT sin tratamiento (n=6); c) grupo OT+salbutamol agudo, en el que se administró tratamiento agudo con salbutamol (n=6) inmediatamente antes de la evaluación de la función muscular, y d) grupo OT+salbutamol crónico, en el que se administró el salbutamol de forma crónica (n=6), desde el comienzo de la obstrucción de la vía aérea y durante 7 días con implantes de minibombas de liberación continua.

El protocolo experimental respetó las recomendaciones de la Comisión Honoraria de Experimentación Animal, de la Universidad de la República. El día 1, se anestesió a todos los animales con pentobarbital sódico (50mg/kg, vía intraperitoneal) 30min después de que se les hubiera administrado atropina (0,04mg, vía intraperitoneal) con el fin de minimizar las secreciones de la vía aérea y prevenir arritmias cardíacas por la manipulación traqueal. Todos los procedimientos se realizaron en condiciones de esterilidad sobre mesa térmica y con los animales respirando espontáneamente con aporte de oxígeno por mascarilla, con una fracción inspiratoria de oxígeno de 1. Se practicó una incisión cervical anterior mediana (previas asepsia y anestesia local con lidocaína al 2%) y se procedió al abordaje de la tráquea extratorácica. En los 3 grupos sometidos a obstrucción de la vía aérea se colocó una banda de polietileno (4×8mm) alrededor de la tráquea, entre el tercer y sexto anillos cartilaginosos. Se midió la presión esofágica, como medida indirecta de la presión pleural, con un catéter de polietileno lleno de agua colocado en el tercio inferior del esófago y conectado a un transductor de presión (9731 P23BC, Statham, Hato Rey, Puerto Rico). La banda de polietileno se ajustó hasta que la presión esofágica inspiratoria en esfuerzos ventilatorios a volumen corriente fuera un 50% mayor del valor basal. De esta forma se obtuvo un aumento significativo de las resistencias de la vía aérea, tal como puede observarse en diferentes situaciones patológicas, tales como las agudizaciones graves del asma, la EPOC o la apnea obstructiva del sueño. En el grupo control se disecó la tráquea y se midió la presión esofágica, tras lo cual se procedió a cerrar la incisión quirúrgica. A los animales del grupo OT+salbutamol crónico se les implantó, de forma subcutánea en la región interescapular, una minibomba de liberación osmótica (Alzet modelo 2001, San Diego, CA, EE.UU.) para asegurar una infusión continua de salbutamol de 1mg/kg/día. Esta dosis se ha considerado clínicamente relevante en estudios experimentales18. Todos los animales se recuperaron de la anestesia sobre la mesa térmica, con aporte de oxígeno, en un plazo de 30min, tras lo cual permanecieron en jaulas individuales con agua y comida ad libítum durante 7 días. Pasado ese período se anestesió de nuevo a las ratas con la misma técnica y se abordó la región cervical anterior para colocar un catéter en la arteria carótida izquierda. En el grupo OT+salbutamol agudo se administró salbutamol a dosis de 25μg/kg por vía intravenosa15. Pasados 5min de estabilización se tomaron las muestras de sangre para gasometría arterial y se procedió a la eutanasia mediante exanguinación.

Para el estudio de la fuerza muscular diafragmática se extrajeron tiras de tejido del hemidiafragma izquierdo de entre 3 y 5mm de ancho, y se conservaron las inserciones costal y tendinosa. El diafragma se conservó en solución de Krebs-Ringer bicarbonato —pH=7,40±0,02; contenido (mM): glucosa, 11,5; NaCl, 138; KCl, 5,9; CaCl2, 1,4; MgSO4, 0,9; NaH2PO4, 1,2; NaHCO3, 25— a 37°C y una mezcla del 95% de oxígeno y el 5% de anhídrido carbónico para oxigenar y mantener el pH de la solución. Los fragmentos diafragmáticos se colocaron en un dispositivo diseñado para medir la fuerza muscular (Myobath-2, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, EE.UU.), bajo perfusión de baño (Krebs-Ringer bicarbonato en iguales condiciones), con control termostático de temperatura a 37°C y flujo continuo que permite el recambio completo del baño cada 15min. En el grupo OT+salbutamol agudo se agregó salbutamol al baño a una concentración de 20μg/l. Este valor se corresponde con las concentraciones plasmáticas alcanzadas en humanos después de una dosis oral de 4mg de salbutamol15. Las tiras musculares se colocaron verticalmente, con el extremo tendinoso hacia arriba ajustado a un transductor de tensión (Fort 100, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, EE.UU.) y montado en un soporte móvil para el registro de la tensión muscular. Las señales se adquirieron con un amplificador (TBM4M, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, EE.UU.) y un sistema computarizado para adquisición y procesamiento de señales (Anadat 5.2, RHT-InfoDat Inc., Montreal, Quebec, Canadá). Las fibras musculares se estimularon de forma indirecta a través de 2 electrodos de platino situados a ambos lados de las mismas (Somatosensory Stimulator S10DSCMA, Grass Instrument Co., Quincy, MA, EE.UU.).

Una vez colocadas las tiras en el sistema de registro, se determinaron el voltaje máximo de estimulación y la relación fuerza-longitud óptima (Lo). La fuerza muscular se estudió para todos los estímulos con Lo y voltaje supramáximo. Después de un período de 15min de estabilización, se aplicaron estímulos eléctricos aislados para estudiar la contracción simple. Las características de ésta se evaluaron midiendo el pico de tensión máxima de la contracción (Tmáx), el tiempo de contracción (TC, tiempo al pico de tensión) y el tiempo de relajación media (TR1/2), definido como aquel en que la Tmáx alcanzada cae a la mitad de su valor. También se analizaron la relación dT/dtmáx (máxima pendiente de ascenso del Tmáx) y −dT/dtmáx (máxima pendiente de descenso del Tmáx) como parámetros de velocidad de contracción y relajación, respectivamente. Con posterioridad se aplicó una serie de estimulaciones tetánicas a frecuencias de 10, 20, 50 y 100Hz, con trenes de estímulo de 1s de duración y con un intervalo de 5s entre cada uno de ellos para construir la curva fuerza-frecuencia.

Finalizado el protocolo de estimulación, se midieron la longitud y el peso de la tira diafragmática para Lo. El área de sección transversal del músculo se estimó con la siguiente fórmula: área de sección transversal=masa músculo (g)/Lo (cm) ×1,056 (g/cm3). El valor 1,056 corresponde a la densidad del músculo expresada en g/cm3. El área de sección transversal se utilizó entonces para calcular la tensión —es decir, la relación fuerza/área— de cada segmento muscular, expresada en N/cm2.

Todas las variables analizadas mostraron una distribución normal. Se realizó el test de homogeneidad de Levene, que mostró varianzas sin diferencias entre los grupos. Las curvas fuerza-frecuencia se compararon por análisis de la varianza para medidas repetidas, mientras que el análisis de la contracción simple y de los parámetros gasométricos se realizó por ANOVA de una vía. Posteriormente se llevó a cabo un análisis post hoc (Student-Newman-Keuls) para determinar la diferencia entre los distintos grupos. Los datos se expresaron como media±error estándar. Los resultados se consideraron significativos cuando el valor de p<0,05. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS versión 11.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.).

Los 3 grupos de animales sometidos a OT presentaron una disminución del pH y un aumento de la presión arterial de anhídrido carbónico, de la concentración arterial de bicarbonato y del exceso de bases en sangre arterial, en comparación con los animales sin obstrucción extrínseca de la vía aérea (p<0,05). El valor de exceso de bases en el grupo OT+salbutamol crónico fue mayor que en los otros grupos (p<0,05). No hubo diferencias estadísticamente significativas en los valores de presión arterial de oxígeno entre los 4 grupos. En la tabla 1 se detallan los valores gasométricos obtenidos en los diferentes grupos.

Como se observa en la tabla 2, los animales sometidos a OT extrínseca sin tratamiento adicional (grupo OT) presentaron una reducción significativa del Tmáx y de dT/dtmáx respecto al grupo control (p<0,05). La administración de salbutamol tanto aguda como crónica determinó una mejoría significativa de dichos parámetros cuando se comparó con el grupo OT (p<0,05). La −dT/dtmáx del grupo OT+salbutamol crónico fue significativamente mayor que la del grupo OT (p<0,05). En el análisis de las curvas fuerza-frecuencia (fig. 1) se objetivó un descenso de la fuerza diafragmática en el grupo OT con respecto al grupo control (p<0,05). Los grupos OT+salbutamol agudo y OT+salbutamol crónico presentaron una mejora significativa de la fuerza diafragmática comparados con el grupo OT (p<0,05), y mostraron valores comparables a los del grupo control.

Figura 1.

Comparación de la relación fuerza-frecuencia entre los grupos. □ grupo control; ¿ grupo de obstrucción traqueal (OT); ▴ grupo de OT+salbutamol agudo; ▵ grupo OT+salbutamol crónico. Datos expresados en media±error estándar. *p<0,05 comparado con los otros grupos.

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