A fin de evitar problemas ligados al envejecimiento, se estudiaron ratones macho adultos jóvenes (2 meses de edad, 21-23g de peso corporal) de la cepa A/J a los que se les indujo un enfisema, junto con los respectivos ratones control. Se ha utilizado un modelo clásico de enfisema pulmonar mediante una única instilación (aspiración orofaríngea) de elastasa de alta pureza (EC134GI, Elastin Products Company) con una concentración de 0,15mg/100g de peso o el equivalente a 20U de enzima/100g de peso. Se trata de una metodología validada previamente en otros estudios14,15, en la que se han caracterizado adecuadamente las diferentes etapas del daño alveolar. Al inicio del estudio, los ratones fueron asignados aleatoriamente a dos grupos: a) ratones con enfisema que fueron sacrificados a las 34semanas de evolución de su enfermedad (n=6) y b) grupo control, a los que se les instiló exclusivamente suero fisiológico en la cavidad orofaríngea, y que también fueron sacrificados a las 34semanas tras dicha instilación única (n=7). A lo largo del período de estudio de 34semanas, los animales de ambos grupos recibieron diariamente alimento y agua ad líbitum y permanecieron bajo las condiciones ambientales habituales de estabulación. También mantuvieron los niveles de actividad física habituales en este tipo de animales durante todo el período de estudio.

Se trata de un estudio controlado, diseñado de acuerdo con la normativa vigente en nuestra institución para la experimentación en animales y a la convención de Helsinki sobre la utilización y el cuidado de los mismos. También se ha tenido en cuenta lo dispuesto en la normativa legal vigente (Real Decreto 1201/2005 de 10 de octubre) sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación del Centro para la Investigación Médica Aplicada (CIMA) en Pamplona (Navarra). Cabe señalar que por razones de índole ético los ratones empleados en la presente investigación se utilizaron también en un estudio previo15 cuyo objetivo fue la cuantificación del grado de enfisema mediante el empleo de metodologías diversas.

La confirmación histológica de la presencia de enfisema en los pulmones de los ratones enfermos respecto de los animales control se realizó de forma cuantitativa en un estudio previo15. Por otro lado también se evaluó, en el mismo estudio, en ambos grupos de ratones, la distensibilidad pulmonar previa al sacrificio de los mismos, con la publicación de los datos correspondientes15.

Además, en el presente estudio, en los dos grupos de ratones se procedió, previamente a su sacrificio (semana 34), a la confirmación radiológica de la presencia de enfisema en los animales enfermos mediante tomografía axial computarizada (TAC) (fig. 1A-B). También se determinó el peso de todos los animales: a día 0 e inmediatamente antes de su sacrificio (semana 34). Dada la edad de los animales, la tendencia en todos ellos fue a ganar peso a lo largo del período de estudio. En todos los ratones se ha utilizado como variable de estudio el porcentaje de ganancia de peso corporal a la semana 34 respecto del peso de cada animal al inicio (basal, día 0).

Figura 1.

A) Tomografía axial computarizada de pulmón de ratón control. B) Tomografía axial computarizada de pulmón de ratón tratado con elastasa. C) Tinción de hematoxilina/eosina de pulmón de ratón control. D) Tinción de hematoxilina/eosina de pulmón de ratón tratado con elastasa. La flecha señala una zona del parénquima pulmonar en la que se aprecia un aumento del espacio interalveolar.

(0.64MB).

En los dos grupos de ratones se obtuvieron los músculos diafragma y gastrocnemio y los pulmones. Para ello se administró, previo al sacrificio, pentobarbital sódico 50mg/kg por vía intraperitoneal y, tras comprobar que el animal estaba completamente anestesiado, sin ningún dolor, se procedió a la realización de las extracciones correspondientes, comenzando por el músculo de las extremidades y finalizando por el diafragma y los pulmones. Una vez extraídos los músculos del animal, se procedió a su congelación inmediata con nitrógeno líquido, para su posterior conservación a –80¿C. Los pulmones fueron extraídos y fijados en formol a una presión constante de 20cmH2O, para ser posteriormente incluidos en parafina con el fin de realizar los bloques y cortes histológicos correspondientes15.

Las variables numéricas (porcentajes de cambio de peso y densidades ópticas para cada marcador) se expresan como media y desviación estándar en cada grupo de ratones. La comparación de medias de cada variable entre ambos grupos se realizó mediante la prueba del t-test para muestras independientes. El nivel de significación estadística se estableció a partir de un valor de p<0,05.

En el presente estudio, la confirmación cualitativa de la presencia de enfisema en los ratones tratados con elastasa respecto de los animales control se realizó mediante técnicas radiológicas (TAC) y la tinción de hematoxilina-eosina (fig. 1A-D, respectivamente). Transcurrido el periodo de estudio (semana 34), la ganancia de peso corporal total de los ratones enfisematosos fue significativamente menor que la ganancia de peso corporal de los ratones control (tabla 2). De igual manera, los pesos de los músculos objeto del presente estudio —diafragma y gastrocnemio— de los ratones enfisematosos fueron también significativamente inferiores a los pesos de los músculos de los ratones control (tabla 2).

En el diafragma y el gastrocnemio de los animales con enfisema, respecto de los animales control, no se observaron diferencias significativas en los niveles totales de proteínas ubiquitinadas, la subunidad C8 del proteasoma, la ligasa E2 atrogin-1, la enzima E214k conjugante de la ubiquitina o la ligasa E3 MURF-1 (tabla 3).

Se observó una disminución significativa de los niveles de miosina (67%) en el diafragma de los ratones con enfisema respecto de los controles (fig. 6), pero no en el gastrocnemio (tabla 3). Los niveles proteicos de actina y creatincinasa no mostraron diferencias significativas entre ambos grupos de animales en el músculo respiratorio o periférico (tabla 3).

Figura 6.

Contenido proteico de miosina en el músculo diafragma de ratones con enfisema y animales control. D.O.: densidad óptica. u.a.: unidades arbitrarias. Valores de media y desviación estándar. *p<0,05.

(0.05MB).

En el diafragma de los ratones enfisematosos se ha observado un aumento de los niveles proteicos de FoxO1, factor de transcripción implicado en la vía del IGF-1/AKT y regulador de la expresión de genes implicados en vías de degradación proteica y atrofia muscular, como atrogin-118,19. En un estudio previo20, en el que se generaron ratones transgénicos caracterizados por sobreexpresar FoxO1, se observó una pérdida de peso respecto de los ratones control y una disminución en la masa de diversos músculos de las extremidades20. Así mismo se detectó que la expresión de los genes relacionados con las proteínas estructurales de las fibras tipo I estaba disminuida20. Desde un punto de vista histológico se observó una disminución del tamaño de las fibras tipo I y II, un decremento del porcentaje de fibras tipo I, detectándose además un aumento del catabolismo proteico20. En el diafragma de pacientes con EPOC también se puso de manifiesto un aumento de la expresión de FoxO12, así como en el diafragma de pacientes expuestos a ventilación mecánica prolongada13. Sin embargo, los niveles de FoxO en el músculo periférico de los ratones con enfisema no resultaron ser diferentes de los de los animales control. Se podría concluir que el factor de transcripción FoxO parece jugar un papel relevante en la señalización de una degradación proteica aumentada en el músculo esquelético en modelos murinos experimentales y en los pacientes con EPOC.

Se han descrito 4 subfamilias de la vía de las MAPK: ERK1/2, JNK, ERK5 y p38. Esta vía de señalización está implicada, entre diversas funciones celulares, en la degradación de proteínas21. Respecto de los animales control, los niveles de ERK1/2 fueron significativamente más elevados en los diafragmas de los ratones con enfisema, mientras que los niveles de JNK resultaron ser mayores en el gastrocnemio de los mismos animales. En modelos experimentales se ha implicado tanto a JNK como a ERK1/2 en la señalización de sistemas de proteólisis celular21. Sin embargo, en una investigación reciente de nuestro grupo (observaciones no publicadas) se ha demostrado que la vía señalización de MAPK no estaba alterada en el cuádriceps de pacientes con EPOC avanzada.

Por otra parte, se ha observado también un aumento de los niveles proteicos de la subunidad p50 de la vía del NF-kB en el músculo periférico, no siendo así en el diafragma. La vía del NF-kB/IKKB ha sido ampliamente estudiada y, entre múltiples funciones, se ha descrito su implicación directa en procesos y enfermedades que cursan con una disminución de masa muscular y atrofia22. Así, la pérdida de masa muscular observada en el gastrocnemio de los ratones enfisematosos podría estar también mediada por esta vía de señalización. Estos datos se corresponden con otros publicados en un estudio en el que se demostró un aumento de la señalización mediante la vía del NF-kB en el vasto lateral de pacientes con EPOC grave y pérdida de masa muscular23. Otro trabajo reciente24 también ha puesto de manifiesto un aumento de la expresión del NF-kB en el diafragma de pacientes con EPOC grave. En resumen, esta vía de señalización parece jugar un papel clave en el proceso de proteólisis muscular en modelos experimentales y en los músculos respiratorios y periféricos de pacientes con EPOC avanzada.

En el diafragma, pero no en el gastrocnemio, de los ratones con enfisema respecto de los animales control, los niveles del factor de crecimiento muscular miogenina estaban disminuidos, mientras que los de miostatina estaban aumentados. Estos resultados se corresponden claramente con los obtenidos en un estudio muy reciente24, en el cual se reportó un decremento de los niveles de miogenina y un aumento de los de miostatina en el diafragma de pacientes con EPOC grave y muy grave. La miostatina es un potente inhibidor del crecimiento de la masa muscular y se cree que podría inhibir la proliferación y la diferenciación de las células musculares precursoras, que a su vez podrían tener capacidad para regular positivamente la degradación de proteínas mediante el sistema ubiquitina-proteasoma24–26. Por otra parte, la miogenina es un factor de crecimiento que favorece la proliferación y la diferenciación de las fibras musculares. Datos recientes (observaciones no publicadas) han revelado hallazgos muy similares en el vasto lateral de pacientes con EPOC grave y pérdida de masa muscular por lo que respecta a los niveles de miostatina y de miogenina en dichos músculos. Cabe tener en cuenta, de hecho, que el presente estudio obedece a un modelo de menor aumento del tamaño de peso corporal y de masa de los músculos en los ratones enfermos y no a un modelo de pérdida de peso. En este sentido, el aumento de los niveles del inhibidor del crecimiento muscular miostatina junto con la disminución de los niveles del factor potenciador del crecimiento muscular miogenina parece guardar coherencia con el modelo experimental de menor ganancia de peso y músculo del presente estudio.

Uno de los hallazgos más relevantes de la presente investigación lo constituye la disminución significativa en el contenido de la proteína contráctil miosina del músculo respiratorio —pero no en el periférico— de los ratones con enfisema respecto de sus controles. Cabe añadir también que en los ratones con enfisema, respecto de los controles, el porcentaje de no ganancia de masa muscular en el diafragma fue del 34%, mientras que en el gastrocnemio resultó ser del 21%. Estas diferencias entre ambos músculos, dentro del mismo grupo de ratones, también podrían explicar el porqué de la disminución de los niveles de miogenina y de miosina solo en los músculos respiratorios en los ratones con enfisema respecto de los animales control, hallazgos que no pueden observarse en el músculo periférico.

Por lo que respecta a la ausencia de diferencias en el contenido de otras proteínas estructurales, aparte de la miosina, también analizadas en el presente estudio, cabe señalar que los hallazgos son similares a los descritos en trabajos previos del grupo basados en el estudio del diafragma7 y el vasto lateral (observaciones no publicadas) de pacientes con EPOC grave. De hecho, mediante microscopia electrónica, en los músculos respiratorios y periféricos del paciente crítico recientemente se ha establecido la existencia de una miopatía que afecta exclusivamente a los filamentos gruesos de la estructura de la sarcómera, es decir a los filamentos de miosina, y no a los de actina. Esta entidad se conoce clásicamente como la miopatía de los filamentos gruesos27. Por analogía a la miopatía que afecta en exclusiva a los filamentos gruesos de la sarcómera de pacientes en estado crítico, cabe plantearse que el menor contenido de miosina detectado en el diafragma de los ratones con enfisema del presente modelo está en la misma línea argumental. Si bien en el presente trabajo no se ha tenido acceso al estudio de la estructura muscular por las limitaciones esgrimidas más abajo (véase «Limitaciones del estudio»), cabe pensar que de producirse alteraciones estructurales en el diafragma de los ratones con enfisema, estas afectarían también muy probablemente a los filamentos de miosina.

Es preciso comentar también que en el presente estudio no se han observado diferencias entre los dos grupos de ratones respecto a las vías de proteólisis analizadas (proteínas ubiquitinadas). Conviene destacar que el hecho de no haber observado diferencias en los marcadores de proteólisis analizados en el presente estudio y sí en las vías de señalización conduce a pensar que en los músculos de los ratones con enfisema podrían estar implicados otros mecanismos de degradación proteica, como las proteasas activadas por calcio, los lisosomas y la autofagia. Por razones relacionadas con el tamaño de los especímenes musculares, dichos sistemas de proteólisis no han sido analizados en la presente investigación, si bien podrían ser objeto de estudio en investigaciones posteriores.

El presente estudio también pone de manifiesto un incremento de los niveles totales de oxidación (proteínas carboniladas y aductos proteicos de MDA) de proteínas musculares en el diafragma, pero no en el gastrocnemio, de los ratones enfermos respecto de sus controles. Estos resultados se corresponden con los obtenidos en estudios previos de nuestro grupo5,7, en los cuales se demostró que los diafragmas de pacientes con EPOC mostraron un aumento de los niveles de oxidación proteica en sus diafragmas5, y que dichas proteínas resultaron ser la creatincinasa, la anhidrasa carbónica III, la actina y la miosina7. Dado que las proteínas carboniladas y los aductos proteicos de MDA son potentes marcadores de estrés oxidativo, cabría concluir que el diafragma de los ratones enfisematosos del presente estudio muestra un claro aumento de los niveles de oxidación proteica. Ello puede obedecer a las contracciones musculares continuadas e intensas a las que se ha visto sometido este músculo en los ratones con enfisema a lo largo de todo el período de estudio. Por otro lado, la relativamente escasa actividad del músculo periférico, por oposición al diafragma, especialmente en los animales portadores de enfisema, podría explicar la ausencia de alteraciones en los niveles de estrés oxidativo en el músculo de las extremidades en dichos animales.

El contenido del antioxidante mitocondrial Mn-SOD estaba disminuido en los diafragmas de los ratones enfermos, concluyendo así que los sistemas antioxidantes mitocondriales se encontraban afectados en el músculo respiratorio. Ello podría contribuir a un incremento en la producción de oxidantes en el compartimento mitocondrial, ya que los sistemas antioxidantes disminuidos no tendrían suficiente capacidad para neutralizar la abundante producción de radicales oxigenados en el diafragma de los ratones con enfisema, sometidos crónicamente a elevadas cargas respiratorias. Esto resultaría, por tanto, en un equilibrio a favor de los oxidantes. Conviene destacar que en pacientes con EPOC, los niveles de Mn-SOD y catalasa no se vieron modificados en el diafragma de pacientes con EPOC grave respecto de los controles sanos5. En el caso de los sistemas antioxidantes citoplasmáticos como son la CuZn-SOD y la peroxiredoxina-2 se observó un aumento de los niveles proteicos de estos en el diafragma de los ratones enfermos. Esto podría ser debido al intento por parte de los sistemas antioxidantes celulares de neutralizar el exceso de oxidantes pero sin lograrlo totalmente, dado que se produjo un aumento final de los niveles de oxidación proteica.

Hay que destacar, por otro lado, que la moderada reducción en el contenido de algunos de los sistemas antioxidantes citosólicos en el gastrocnemio de los animales enfermos no tuvo repercusión en el equilibrio redox final de los músculos periféricos. Estos hallazgos contrastan con los reportados en el cuádriceps de pacientes con EPOC, donde se ha puesto de manifiesto un aumento en el contenido de los enzimas antioxidantes Mn-SOD y CuZn-SOD3,8. Las diferencias en el metabolismo celular y en la actividad muscular entre el modelo murino y los pacientes con EPOC podrían explicar las disimilitudes en el contenido de las diversas enzimas antioxidantes, así como en el equilibrio redox final observado en cada músculo.

He aquí las limitaciones más destacables del presente estudio: En primer lugar, debido a la falta —por razones de tamaño de las muestras musculares en el ratón— de preparaciones histológicas de ambos músculos, no ha sido posible analizar las posibles alteraciones estructurales, como la composición fibrilar de cada músculo, así como sus tamaños. En segundo lugar —también por razones logísticas experimentales relacionadas con el tamaño de los animales—, tampoco se ha podido valorar la función muscular de los animales. Dadas las limitaciones del tamaño de los especímenes, en el presente estudio se priorizó de forma absoluta, en una primera instancia, la determinación de forma exhaustiva de los mecanismos moleculares potencialmente implicados en la pérdida de masa muscular en este modelo de enfisema pulmonar experimental. Una vez identificados los mecanismos moleculares más predominantes y verificada la existencia de alteraciones moleculares en los músculos de ratones portadores de un enfisema experimental será posible, en futuros estudios, destinar gran parte de las muestras a describir potenciales alteraciones estructurales presentes en los músculos respiratorios y periféricos en ratones con enfisema.