A partir del servicio respiratorio se incluyeron 15 pacientes con EPOC (estadio de la iniciativa Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD] II [n=4], III [n=4] y IV [n=7]). Los criterios de exclusión fueron insuficiencia cardíaca, renal o hepática o una enfermedad inflamatoria sistémica, metabólica o neuromuscular o una exacerbación moderada/grave (es decir, con necesidad de antibióticos, esteroides orales u hospitalización) en las 4 semanas previas. Mediante un anuncio se reclutaron 8 individuos control, sanos. Los individuos dieron su consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el comité de investigación del Royal Brompton y Harefield NHS Trust y el Ealing and West London Mental Health Trust.

De acuerdo con las guías de la American Thoracic/European Respiratory Society, se determinaron la espirometría posbroncodilatador16, los volúmenes pulmonares con pletismografía17, la capacidad de difusión del monóxido de carbono18 y la gasometría arterial se examinó en una muestra de sangre arterializada, obtenida del lóbulo de la oreja. La masa magra se determinó mediante impedancia bioeléctrica (dispositivo Bodystat® 1500, Bodystat, Reino Unido)19 y se corrigió para la estatura para derivar el índice de masa magra. La actividad física se determinó con un acelerómetro triaxial Dynaport® ADL3; McRoberts BV, Países Bajos), que los pacientes utilizaron durante 2 días, 12 horas cada día, durante una actividad normal. El tiempo de locomoción media se calculó como se ha descrito previamente20. La fuerza del cuádriceps (pierna derecha) se evaluó con la contracción voluntaria máxima isométrica, en decúbito supino, basada en el método de Edwards21. La biopsia percutánea con aguja en el músculo vasto lateral derecho se efectuó con anestesia local utilizando la técnica de Bergstrom22. Las muestras para el análisis de ácido ribonucleico y proteínas se congelaron de inmediato en nitrógeno líquido, al mismo tiempo que las muestras para histología se introdujeron en isopentano preenfriado durante 15 seg antes de congelarse en nitrógeno líquido, y acto seguido, se almacenaron a –80°C.

No se dispuso de tejido suficiente a partir de todos los individuos para efectuar los análisis y por esta razón para cada análisis se usó un subgrupo de muestras.

Los cortes congelados de 10 μm de 10 pacientes y 8 individuos de control se fijaron en una solución de formaldehído al 10%, se lavaron en Triton X-100 al 0,1% en una solución salina neutralizada con fosfato (PBS) y se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 5% en PBS, antes de incubación con un anticuerpo de conejo anti-YY1 (dilución 1:400, sc-281; Santa Cruz Biotechnology, Estados Unidos) y un anticuerpo murino anti-cadena pesada de la miosina de contracción rápida (MYSN02, dilución 1:200, Abcam, Reino Unido) en BSA al 3% en PBS durante toda la noche a 4°C. Tras una incubación de 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (A11008 Invitrogen y A11005 Invitrogen, dilución 1:250 en PBS), los cortes se trataron con diaminodifenilindol (DAPI). Las imágenes (dos campos por muestra, dos cortes por individuo) se obtuvieron utilizando un microscopio de campo ancho Zeiss Axiovert con una lente de 10× y un programa informático Improvision Volocity. Mediante un microscopio Leica SP2 se obtuvieron imágenes confocales con una lente de inmersión en aceite 63x y se analizaron con un programa informático LCS Lite (Leica Microsystems, Alemania).

YY1 no es abundante en el músculo esquelético de adultos y, por consiguiente, antes de la inmunotransferencia fue necesaria la inmunoprecipitación. A partir de nueve pacientes y siete individuos control, para este análisis estuvieron disponibles 3-6 mg de proteína.

Se incubaron 3-6 mg de proteína homogeneizada en solución con Nonidet P40, cócteles de inhibidor de la proteasa y de inhibidor de la fosfatasa (Sigma, Poole Dorset, Reino Unido) en hielo durante 30 min con 30 μl de cuentas Protein G-Sephorose. Después de 2 min de centrifugación (8.000 rpm), el sobrenadante se incubó durante 1 h en hielo con 1 μg de anticuerpo de conejo anti-YY1 (sc-281, Santa Cruz Biotechnologies, Estados Unidos). Para cada muestra se añadieron otros 30 μl de cuentas de Protein G-Sephorose y se reincubaron en hielo durante 1 h. Las muestras se centrifugaron de nuevo y se desechó el sobrenadante. Las cuentas se lavaron en Nonidet P40 y se hirvieron con 30 μl del tampón de la muestra (tampón de carga y 2-mercaptoetanol) durante 5 min a 100°C. Este proceso se optimizó para garantizar que el sobrenadante no contendría una cantidad detectable de YY1 en la inmunotransferencia.

Las muestras se analizaron utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato (SDS/PAGE) (gel al 10%) y una técnica de inmunotransferencia semiseca (LKB). Tras el bloqueo (BSA al 5% en PBS), las membranas se incubaron con un anticuerpo de ratón anti-YY1 (ab58066, dilución 1:200, Abcam, Reino Unido) en BSA al 3% en PBS durante toda la noche a 4°C, y acto seguido, con un anticuerpo IgG murino unido a peroxidasa de rábano picante (ab 6728, Abcam, Reino Unido, 1:5.000 en BSA al 3% en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas se visualizaron mediante Supersignal (Pierce, Rockford, IL, Estados Unidos), determinándose la densidad de la banda con un análisis de densitometría 1D (AIDA, Raytek, Sheffield, Reino Unido) y se normalizaron para la cantidad de proteínas usadas en la inmunoprecipitación.

A partir de todos los individuos, los cortes musculares transversales congelados de 10 μm se incubaron con anticuerpos primarios para la miosina tipo I, miosina tipo IIa y laminina (A4.840 y N2.261 Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Estados Unidos, y L-9393 Sigma, Zwijndrecht, Países Bajos, respectivamente) seguido de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (A-21121, A-21426 y A-11069, Invitrogen)23. La señal de epifluorescencia se registró utilizando un filtro de excitación Texas Red (540-580 nm) para la miosina tipo I, un filtro de excitación FITC (465-495 nm) para la miosina de tipo IIa y un filtro de excitación UV DAPI (340-380 nm) para la laminina utilizando un microscopio Nikon Eclipse 800. Las fibras se clasificaron en tipo I, IIa, IIx (sin tinción) e híbridas I/IIa (tinción dual) y se utilizó el borde de laminina de las fibras para calcular el AT de cada fibra (y a partir de ésta, el AT mediana para cada tipo de fibra) y las proporciones de fibras utilizando el programa estadístico Lucia 4.81 (Nikon, Japón)24. Para cada individuo se analizó una mediana de 207 fibras con un mínimo de 103 fibras.

Los transcritos de ARNm de TNF-α se determinaron mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, en tiempo real, utilizando SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en un 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Los transcritos se normalizaron hasta un factor geNorm derivado de dos genes internos, la fosfoproteína ribosómica ácida (RPLPO) y la microglobulina beta-2 (β2M), según lo descrito previamente25. Más adelante se muestran las secuencias de los cebadores (iniciadores):

Los datos no tenían una distribución normal (de acuerdo con el histograma y la prueba de la simetría), por lo que se describen como medianas (percentil 25 y percentil 75). Las diferencias de grupo en las variables continuas se analizaron con la prueba de la U de Mann Whitney, mientras que se usó la prueba exacta de Fisher para probar las diferencias de grupo en las variables categóricas. Se calculó el coeficiente de correlación de rangos de Spearman (ρ) para determinar la relación entre las variables (Statview 1.0, Abacus Instruments). Para definir la significación estadística se utilizó un valor de p bilateral (dos colas) ≤ 0,05.

YY1 estuvo ausente del núcleo pero presente en el citoplasma en los cortes de cuádriceps de los individuos de control, sanos (fig. 3 y fig. 4C, D, G, H). YY1 en el citoplasma se alineó con los sarcómeros, pero no se colocalizó con la miosina (fig. 3).

Figura 3.

Imagen con microscopio de campo ancho de un corte longitudinal de músculo cuádriceps de un individuo control, sano, demostrándose la localización de YY1 en relación con los núcleos musculares mediante inmunohistoquímica. El músculo se tiñó para YY1 (verde), la cadena pesada de la miosina rápida (rojo) y los núcleos utilizando 4’,6-diamidino-2-fenilindol (azul). Se observa la tinción de YY1 a lo largo de los sarcómeros, no colocalizada con la miosina, y la ausencia de los núcleos.

(0.19MB).

Figura 4.

Imágenes en el microscopio de cortes musculares de cuádriceps de pacientes con EPOC e individuos ontrol, demostrándose en los miotúbulos la localización de YY1 con inmunohistoquímica en relación con los núcleos musculares. A-D: imágenes con microscopio de campo ancho y E-H: imágenes con microscopio confocal de cortes transversales de cuádriceps que demuestran la tinción de YY1 en verde y para los núcleos con 4’,6-diamidino-2-fenilindol en azul (B, D, E y G) y los mismos cortes que muestran tinción para YY1 sólo en verde (A, C, F y H). A, B, E y F muestran los cortes de un paciente en el que se identificó el patrón anómalo de tinción del factor tanto en el núcleo como en el citoplasma. C, D, G y H corresponden a un individuo de control en el que se demostró una tinción exclusivamente citoplasmática de YY1.

(0.54MB).

En ninguno de los individuos control, pero sí en 5 de los 10 pacientes se demostró tinción YY1 en la región nuclear; esta diferencia entre grupos fue estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher, p=0,04). Comparado con 6 de los 8 individuos control, sólo en 2 de los 10 pacientes se demostró una distribución de YY1 exclusivamente citoplasmática, que, una vez más, fue estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher, p=0,05). No se identificó una diferencia significativa entre pacientes con localización nuclear de YY1 y pacientes sin ella por lo que respecta a la función muscular o pulmonar, AT de las fibras del cuádriceps o niveles de proteína YY1.

Naturalmente, el presente estudio adolece de limitaciones. En primer lugar, el tamaño de la muestra fue pequeño y las asociaciones detectadas tuvieron que distinguirse, por lo que, es posible que, debido a la falta de potencia, no se identificaran otras asociaciones o diferencias de grupo. Los individuos control incluidos en el presente estudio se caracterizaron por un índice de masa magra relativamente bajo y una amplia varianza en su grado de actividad física, para lo que no hay una explicación clara, lo que aumenta el umbral de la significación estadística de las diferencias de grupo. Aunque el estudio de pacientes en estadio II, III y IV de la iniciativa GOLD tendría que haber facilitado el hallazgo de correlaciones entre la función muscular y pulmonar y los niveles de YY1, porque no sería de esperar que los datos se agruparan, la utilización de pacientes en un estadio IV exclusivo podría haber aumentado al máximo la probabilidad de encontrar una diferencia significativa en la expresión de YY1 entre pacientes e individuos de control. En segundo lugar, el diseño observacional no permite la extracción de conclusiones acerca del efecto de las diferencias en YY1 sobre la estructura y función muscular, lo que meramente destaca una asociación entre el aumento de expresión del factor y el tamaño más pequeño de las fibras y entre la localización nuclear del factor y la presencia de EPOC y una fuerza menor del músculo cuádriceps que en individuos control. Por último, utilizamos la localización y expresión del factor como variable indirecta de la actividad porque YY1 es activado por transporte desde el citoplasma hasta el núcleo. Podrían haber corroborado nuestros hallazgos la cuantificación de YY1 unido a ADN (inmunoprecipitación de la cromatina, una técnica no publicada previamente sobre el uso en músculo del ser humano) o la cuantificación de YY1 capaz de unión a ADN (por ejemplo, mediante análisis electroforético del cambio de movilidad).

También podría argumentarse que el factor YY1 detectado en los núcleos no está presente en la periferia de las miofibrillas, sino en las células satélite, latentes. Sin embargo, consideramos que esto es improbable ya que las células satélite sólo representan el 2-5% de los núcleos del músculo28. Incluso suponiendo un aumento masivo de la población de células satélite en el tejido de los pacientes, el número de núcleos que se tiñeron para el factor supera considerablemente el número que podrían explicar las células satélite. Además, en las muestras del presente estudio, la ausencia de núcleos centralizados sugiere una activación limitada de las células satélite en el período de tiempo en torno a la obtención de las muestras.

La implicación de una potente correlación inversa entre los niveles de factor YY1 y el tamaño de las fibras es que YY1 podría participar en el mecanismo de la atrofia de las fibras, en particular dado que la relación es más potente con el AT de las fibras de tipo IIx y estas fibras parecen ser el tipo que más se atrofia en la EPOC26. Sin embargo, esta hipótesis requeriría una investigación adicional, por ejemplo, examinando el efecto en el músculo esquelético de ratones adultos knockout o knockdown con enfisema inducido por el humo del tabaco u otros medios.

El hallazgo de que los pacientes con una localización nuclear del factor no necesariamente poseen niveles más altos puede explicarse por el hecho de que su localización y expresión pueden regularse de manera independiente. Es posible que los pacientes con una mayor expresión de YY1 y un tamaño más pequeño de las fibras se caractericen por mayores niveles de activación de NF-κB en el músculo, mientras que en otros una mayor reserva de actina despolimerizada daría lugar a una acumulación nuclear del factor sin un aumento de su expresión. No obstante, no encontramos una correlación entre los valores locales de TNF-α e YY1 en el músculo de los pacientes, lo que respalda la sugerencia de que los niveles del factor están determinados principalmente por TNF-α local que activaría el factor NF-κB.

En conclusión, describimos el nuevo hallazgo de que YY1, un factor de transcripción de represión de la expresión génica específica de músculo y la miogénesis, se expresa asociado a una disminución del AT de las fibras de tipo IIx y tipo I del músculo cuádriceps en la EPOC. YY1 también se localiza en los núcleos del cuádriceps de pacientes con EPOC, en comparación con individuos control, sanos, emparejados por edad. Especulamos que la mayor actividad de YY1 podría estar implicada en el deterioro de la regeneración del músculo esquelético y la atrofia de las fibras musculares en la EPOC.