La persistencia de la tuberculosis (TB) está asociada a varios factores entre los que destacan: los problemas socioeconómicos, el aumento de la coinfección con el VIH y el creciente aumento de la resistencia a los fármacos antituberculosos1.

La situación actual de la tuberculosis resistente en el mundo es preocupante; se estima que anualmente se producen cerca de 500.000 casos de tuberculosis multirresistente (MDR-TB), definida como resistencia al menos a isoniacida y rifampicina2, lo que representa aproximadamente el 3,5% de todos los casos nuevos de TB. Aunque con grandes diferencias geográficas, en la mayor parte de los países del mundo ya ha sido diagnosticado algún caso de tuberculosis extremadamente resistente (XDR-TB), definida como MDR-TB con resistencia añadida a alguna fluoroquinolona y, al menos, a un fármaco inyectable de segunda línea, lo cual da una idea de la magnitud del problema3.

La incidencia de TB sigue descendiendo en España; este comportamiento epidemiológico es similar al de los países de nuestro entorno4, pero la aparición de cepas MDR y XDR-TB, ponen en riesgo el control de la enfermedad, por lo que es recomendable estudiar todas las cepas circulantes.

La tasa de incidencia de TB en Asturias en 2013 fue de 14,98 casos por 100.000 habitantes5, algo superior a la media nacional que fue de 11,88 casos por 100.000 habitantes6.

El conocimiento de la situación de las resistencias en cepas de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) en un área geográfica, permite adecuar las pautas de tratamiento a las necesidades de la población y nos indica la idoneidad de las pautas terapéuticas existentes7.

Hay diferentes metodologías para conocer el patrón de sensibilidad de los aislamientos clínicos; el método más exacto y el que menos resultados falsos proporciona es el método de las proporciones múltiples establecido por Canetti en 19638,9, por lo que es el más utilizado en todo el mundo.

La demora inherente a las pruebas de sensibilidad convencionales hace que el interés por las técnicas moleculares sea cada vez mayor, ya que permiten obtener resultados en cuestión de horas, siendo este un factor crítico para poder establecer lo más pronto posible una pauta farmacológica adecuada. Sin embargo, el principal inconveniente es que, con excepción de la rifampicina en la que el 97% de las resistencias están codificadas por el gen rpoB, desconocemos las alteraciones genéticas que causan entre un 20 y un 40% de las resistencias al resto de fármacos de primera línea10; sin olvidar que su coste elevado, puede suponer un obstáculo para países con recursos económicos escasos.

El grado de incertidumbre de los métodos moleculares actuales justifica la necesidad de seguir realizando pruebas de sensibilidad fenotípicas, siendo además recomendable que la metodología empleada se ajuste a estándares de calidad internacionalmente aceptados, y que pueda ser verificada mediante controles de calidad externos que avalen la fiabilidad de los resultados obtenidos. En Asturias la participación en estos programas de control se inició en el año 2004.

Nuestro estudio pretende, como objetivo principal, valorar la aportación de las nuevas técnicas moleculares al diagnóstico de resistencias de M. tuberculosis comparándolas con el método fenotípico de referencia y conocer la situación de las resistencias a fármacos antituberculosos de primera línea en Asturias.

Estudio prospectivo que incluye la totalidad de las cepas de M. tuberculosis procedentes de muestras clínicas aisladas en Asturias durante el período comprendido entre enero de 2004 y diciembre de 2013.

Los criterios de inclusión de los aislamientos fueron: en pacientes con varias muestras del mismo origen, se incluyó el primer aislamiento de M. tuberculosis obtenido de cada paciente. En el caso de pacientes con muestras de diferentes orígenes, se incluyó una cepa de M. tuberculosis por cada localización de la tuberculosis.

Para las pruebas de sensibilidad se siguieron las directrices del Clinical and Laboratory Standards Institute11, realizándose el método de las proporciones múltiples de Canetti en Middlebrook 7H10 como método de referencia. Se analizaron las siguientes concentraciones críticas: isoniacida 0,2μg/ml, rifampicina 1μg/ml, etambutol 5μg/ml y estreptomicina 2μg/ml. Este método fue realizado tanto a las 1.861 cepas de M. tuberculosis incluidas en el estudio, como a los controles de calidad de la OMS recibidos de forma periódica durante la década estudiada.

En cuanto a la detección molecular de resistencias, en el caso de la isoniacida y rifampicina se realizó a todas las cepas incluidas en el estudio, mientras que para el etambutol y la estreptomicina se realizó solamente a las 102 cepas que presentaron resistencia fenotípica a algún fármaco de primera línea. Los métodos comerciales utilizados para las diferentes dianas fueron: rpoB, katG, inhA, gyrA, gyrB, rrs, eis (INNOLiPA RIFTB©; GenotypeMDRplus©; GenotypeMDRsl©).

Se recogió toda la información en una base de datos diseñada para tal fin con el programa Microsoft Excel. El análisis estadístico fue el recomendado para comparar una técnica diagnóstica con la que se obtienen resultados binarios o dicotómicos (prueba molecular: presencia/ausencia de mutación) con el gold standard (antibiograma fenotípico), construyendo tablas de contingencia para calcular: sensibilidad, especificidad, VPP, VPN.

La capacidad de detección de cepas resistentes de los métodos moleculares, varía mucho en función del conocimiento de los genes implicados en la resistencia a cada uno de los fármacos y la inclusión de esas dianas en los métodos comerciales, siendo en el caso de la rifampicina una herramienta excelente para la detección y sospecha inicial de cepas multirresistentes. El análisis de las cepas de M. tuberculosis aisladas en Asturias durante la década 2004 a 2013, nos revela que la tasa de resistencias a fármacos de primera línea es baja y los casos de multirresistencia son esporádicos.

En nuestra serie, al igual que en otros estudios publicados6, se observa un predominio en hombres, resultando una proporción de 2,1 hombres por cada mujer, cifra superior a la media española de 1,7.

La media de edad fue de 53 años, superior a la media española que es de 44 años5. El grupo de edad que presentó menos casos de TB fue el de los menores de 15 años con 27 casos lo que representa el 1,4% del total12.

Como era de esperar, M. tuberculosis hominis fue la especie más frecuentemente identificada con 1.861 cepas que representan el 98,5%. La localización pulmonar fue la más frecuente 73,9% y la pleural un 6,7%, porcentajes algo superiores a los nacionales donde el 70% fueron de localización pulmonar y un 4,9% pleural13.

El control adecuado de la TB precisa conocer periódicamente la prevalencia de las resistencias de M. tuberculosis a fármacos antituberculosos, sin embargo la magnitud de la resistencia a estos fármacos en España es difícil de calcular ya que se dispone de pocos estudios publicados, y los que hay ofrecen cifras muy variadas de resistencias14. En 2014 se publica el primer estudio prospectivo de resistencias a fármacos antituberculosos de primera línea en una amplia cohorte de pacientes15. Nuestros datos de resistencias globales (iniciales y adquiridas) a uno o más fármacos de primera línea en cepas de M. tuberculosis han sido del 5,5%, inferiores a las publicadas en este estudio (9,2%).

Las tasas de resistencia a cada uno de los fármacos de primera línea fueron inferiores a la media española: isoniacida (3,22 vs. 6,7%); rifampicina (0,37 vs. 1,9%), etambutol (0,59 vs. 1%), estreptomicina (2,68 vs. 4,4%), no se detectó ningún caso con monorresistencia a rifampicina. Así mismo el porcentaje de cepas MDR-TB también fue inferior a la media nacional (0,37 vs. 1,2%). Teniendo en cuenta la relación directa encontrada entre la población inmigrante y los casos de MDR-TB16, la escasa población inmigrante en Asturias (10,4%)17 con respecto a otras comunidades españolas, podría ser un factor determinante.

En lo referente a los métodos moleculares disponibles comercialmente, conviene recordar que no incluyen todas las dianas relacionadas con la resistencia, o bien no contemplan la variabilidad existente en cuanto a los tipos de mutaciones prevalentes en cada área geográfica10. En nuestra serie, se observa una especificidad muy alta que puede ser debida a que se basan en el análisis simultáneo de la mutación y de la secuencia silvestre correspondiente18, sin embargo la sensibilidad es muy variable dependiendo del fármaco analizado.

Se ha demostrado que la resistencia a rifampicina en M. tuberculosis se explica en un 96 a 98% por mutaciones en el gen rpoB19, este hecho facilita enormemente el desarrollo de técnicas moleculares para la detección rápida de la resistencia a la rifampicina en la cepa aislada por cultivo o, incluso, directamente en la muestra clínica.

En el caso de la rifampicina, todos los casos de resistencia fenotípica fueron detectados mediante las técnicas moleculares, correspondiendo los 7 casos a cepas multirresistentes. Por lo tanto estas técnicas ofrecen un gran potencial en la predicción de multirresistencia y permiten establecer desde un inicio una orientación del tratamiento farmacológico más adecuado.

Sin embargo, ni siquiera en el caso de la rifampicina los métodos moleculares deberían excluir a los fenotípicos ya que, entre las cepas analizadas 16 de ellas presentaban una mutación silente TTC/TTT en el codón 514 del gen rpoB que no implicaba resistencia fenotípica20. Estos resultados han sido hallados también por otros grupos de estudio, usando otros métodos moleculares basados en la detección de mutaciones en el gen rpoB21–23.

En el caso de la resistencia a la isoniacida en M. tuberculosis está asociada a múltiples genes (katG, inhA, aphC, ndh, kasA, furA, ethA), siendo los dos primeros los implicados más frecuentemente (60-65% de los casos)18, con importantes variaciones geográficas. De las 1.861 cepas incluidas en nuestra serie, 60 cepas fueron resistentes a la isoniacida por el método de referencia y de ellas, 42 cepas (70%) presentaron mutaciones en los genes katG y/o inhA. El 30% de las cepas resistentes a la isoniacida no presentaba alteraciones del gen katG ni del inhA. Existe la posibilidad de que otros genes involucrados en la resistencia a isoniacida, pero no incluidos en los sistemas comerciales, expliquen el mecanismo de resistencia en estas cepas10.

En cuanto a los restantes fármacos de primera línea, entre el 50-70% de las cepas resistentes a etambutol, contienen una mutación en la región determinante de la resistencia a etambutol (ethambutol resistance determining región) del gen embB24. En la actualidad, los sistemas comerciales para la detección rápida de mutaciones relacionadas con la resistencia al etambutol se basan solo en la diana embB306.

En nuestro estudio, de las 11 cepas que fueron resistentes al etambutol por el método de referencia, 4 cepas (36,36%) presentaron mutaciones en el gen embB y 7 cepas (63,64%) no mostraron ninguna de estas mutaciones.

En el caso de la estreptomicina, se hallan mutaciones en los genes rrs y rpsL en el 55% de los aislamientos resistentes a este fármaco18. La mayoría de las mutaciones puntuales ocurren en el gen rpsL, siendo la mutación más frecuente la que ocurre en el codón 43, que se relaciona con una resistencia de alto nivel; mientras que las que afectan al gen rrs producen una resistencia de nivel intermedio-bajo25 y se hallan principalmente en los codones 530 y 91226–29. Sin embargo, existen cepas con bajos niveles de resistencia fenotípica que no poseen mutación alguna en estos genes, lo que hace postular el papel de otras dianas alternativas, como el gen gidB (que codifica una metiltransferasa específica para el 16S ARNr)30 o incluso bombas de expulsión31.

En el caso de la estreptomicina existen limitaciones en la detección mediante métodos comerciales de mutaciones que producen resistencia, ya que no están incluidas las que se producen en el gen rpsL. En nuestra serie de las 50 cepas que fueron resistentes por el método de referencia, 5 cepas (10%) presentaron mutaciones en el gen rrs-eis y 45 cepas (90%) no mostraron ninguna de estas mutaciones.

Las técnicas moleculares aportan rapidez en la obtención de resultados, sin embargo su sensibilidad varía mucho en función del fármaco estudiado, siendo excelente en el caso de la rifampicina. En ningún caso estas técnicas deberían sustituir a las pruebas de sensibilidad fenotípicas convencionales, ya que una mutación genética no implica en todos los casos una resistencia fenotípica20, así como tampoco la ausencia de mutaciones en los genes citados excluye totalmente la posibilidad de resistencias fenotípicas. De cara al futuro, resulta necesario intensificar la investigación para identificar nuevos mecanismos de resistencia en M. tuberculosis, así como perfeccionar la metodología actualmente existente con la incorporación progresiva de las nuevas dianas identificadas, como en el caso del gen rpsL y la estreptomicina; de los nuevos fármacos para el tratamiento de la tuberculosis (fluoroquinolonas, linezolid, bedaquilina, delamanid, etc.); e idealmente que la detección de mutaciones en todos los genes diana se pudiera hacer de manera simultánea.

Las técnicas moleculares aportan rapidez en la obtención de resultados, sin embargo su sensibilidad varía mucho en función del fármaco estudiado, por lo que los resultados deben confirmarse con las pruebas de sensibilidad fenotípicas de referencia. La tasa de resistencias a fármacos de primera línea en Asturias es baja e inferior a otras zonas de nuestro país y los casos de multirresistencia son esporádicos.

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  Juan José Palacios Gutiérrez: director del trabajo y responsable de la Unidad de Referencia Regional de Micobacterias del Servicio de Microbiología del HUCA.

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  Luz María Alba Álvarez: análisis de datos y redacción.

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  José María García García: Unidad de Gestión Clínica de Neumología, Hospital San Agustín, Avilés: corrección y supervisión del trabajo.

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  María Dolores Pérez Hernández: Servicio de Vigilancia y Alertas Epidemiológicas, Dirección General de Salud Pública, Consejería de Sanidad: aportación y revisión de datos demográficos.

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  Susana Martínez González: revisión bibliográfica.

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  Red de laboratorios de Microbiología del SESPA: aislamiento de las cepas remitidas a la Unidad de Referencia de Micobacterias del HUCA.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.