Las enfermedades con obstrucción crónica de la vía aérea, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asocian alteraciones funcionales de los músculos respiratorios. Los agonistas adrenérgicos β2 mejoran la fuerza muscular en condiciones fisiológicas y patológicas. Nuestro objetivo ha sido estudiar los efectos del salbutamol sobre la contractilidad diafragmática en un modelo animal de obstrucción crónica de la vía aérea lograda por obstrucción traqueal (OT) extrínseca.
Materiales y métodosSe aleatorizaron 24 ratas Sprague-Dawley en 4 grupos: a) control; b) OT; c) OT+salbutamol agudo, y d) OT+salbutamol crónico. Se estudiaron los gases sanguíneos, el equilibrio ácido-base y la fuerza diafragmática in vitro, a través de las siguientes medidas: tensión máxima (Tmáx), tiempo de contracción (TC), velocidad de contracción (dT/dtmáx), tiempo de relajación media (TR1/2), velocidad de relajación (−dT/dtmáx) y curvas fuerza-frecuencia.
ResultadosLos 3 grupos sometidos a OT presentaron una disminución significativa del pH y un incremento de la presión arterial de anhídrido carbónico y del bicarbonato en sangre arterial (p<0,05). El grupo OT experimentó una disminución significativa de Tmáx, de dT/dtmáx y de la curva fuerza-frecuencia en comparación con los otros grupos (p<0,05). La −dT/dtmáx fue mayor en el grupo OT+salbutamol crónico comparado con el grupo OT (p<0,05). Los valores medios (± error estándar) de Tmáx fueron: control, 6,46±0,90N/cm2; OT, 3,28±0,55N/cm2; OT+salbutamol agudo, 6,18±0,71N/cm2; OT+salbutamol crónico, 7,09±0,59N/cm2.
ConclusionesLa disfunción diafragmática asociada a obstrucción crónica de la vía aérea mejora con salbutamol administrado tanto en forma aguda como crónica. Los mecanismos involucrados en la disfunción muscular deben analizarse más profundamente.
Chronic airflow obstruction in conditions such as chronic obstructive pulmonary disease is associated with respiratory muscle dysfunction. Our aim was to study the effects of salbutamol—a β-adrenergic agonist known to improve muscle strength in physiologic and pathologic conditions—on diaphragm contractility in an animal model of chronic airway obstruction achieved by tracheal banding.
Materials and MethodsTwenty-four Sprague-Dawley rats were randomized into a control group and 3 tracheal banding groups, 1 that received acute salbutamol treatment, 1 that received chronic salbutamol treatment, and 1 that received nothing. Arterial blood gases, acid-base balance, and in vitro diaphragmatic contractility were evaluated by measuring peak twitch tension, contraction time, contraction velocity, half-relaxation time, relaxation velocity, and force-frequency curves.
ResultsThe 3 study groups had significantly reduced arterial pH and increased PaCO2 and bicarbonate levels compared to the control group (P<.05). The untreated tracheal banding group had significantly reduced peak twitch tension and contraction velocity, and a significantly lower force-frequency curve in comparison with the other groups (P<.05). The chronic treatment group had a higher relaxation velocity than the untreated study group (P<.05). The mean (SE) peak twitch tension values were 6.46 (0.90)N/cm2 for the control group, 3.28 (0.55)N/cm2 for the untreated tracheal banding group, 6.18 (0.71)N/cm2 for the acute treatment group, and 7.09 (0.59)N/cm2 for the chronic treatment group.
ConclusionsDiaphragmatic dysfunction associated with chronic airflow obstruction improves with both the acute and chronic administration of salbutamol. The mechanisms involved in respiratory muscle dysfunction warrant further study.
Los músculos respiratorios son los encargados de generar la fuerza necesaria para una adecuada ventilación, siendo el diafragma el principal músculo inspiratorio. La disfunción diafragmática puede agravar o determinar insuficiencia respiratoria. En la obstrucción crónica de la vía aérea se desarrollan graves alteraciones estructurales y funcionales en el diafragma1–5, hecho de gran relevancia en la fisiopatología de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Se ha demostrado que el diafragma de los pacientes con EPOC presenta importantes alteraciones estructurales, bioquímicas y metabólicas, así como una reducción de la fuerza contráctil6–12. No obstante, poco se sabe acerca de la posibilidad de prevenir o revertir esta disfunción. Los agonistas adrenérgicos β2 como el salbutamol poseen la capacidad de aumentar la contractilidad diafragmática tanto en circunstancias fisiológicas como patológicas13–16. Esto se ha vinculado fundamentalmente a un efecto inotrópico positivo de estos fármacos, si bien también pueden desempeñar un papel sus propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, anabólicas y antiproteolíticas. Algunos investigadores han demostrado que el tratamiento con salbutamol inhalado en pacientes con EPOC mejora la función del diafragma. Estos efectos se han atribuido a la mejoría de las condiciones de carga del diafragma y no a un incremento de su contractilidad17. Así pues, los efectos del salbutamol sobre la contractilidad diafragmática merecen evaluarse con mayor profundidad.
El objetivo del presente trabajo ha sido estudiar los efectos del salbutamol sobre la contractilidad del diafragma en un modelo animal de obstrucción crónica de la vía aérea, mediante la técnica de la obstrucción traqueal (OT) extrínseca por ligadura. Nuestra hipótesis era que el salbutamol incrementa la fuerza diafragmática en la limitación crónica al flujo aéreo.
Materiales y métodosAnimales y gruposSe estudiaron 24 ratas Sprague-Dawley macho con un peso medio (± error estándar) de 306±30g, en un modelo experimental de obstrucción de la vía aérea por medio de ligadura traqueal de 7 días de evolución. Los animales se aleatorizaron en 4 grupos: a) grupo control, sin OT (n=6); b) grupo con OT sin tratamiento (n=6); c) grupo OT+salbutamol agudo, en el que se administró tratamiento agudo con salbutamol (n=6) inmediatamente antes de la evaluación de la función muscular, y d) grupo OT+salbutamol crónico, en el que se administró el salbutamol de forma crónica (n=6), desde el comienzo de la obstrucción de la vía aérea y durante 7 días con implantes de minibombas de liberación continua.
Protocolo experimentalEl protocolo experimental respetó las recomendaciones de la Comisión Honoraria de Experimentación Animal, de la Universidad de la República. El día 1, se anestesió a todos los animales con pentobarbital sódico (50mg/kg, vía intraperitoneal) 30min después de que se les hubiera administrado atropina (0,04mg, vía intraperitoneal) con el fin de minimizar las secreciones de la vía aérea y prevenir arritmias cardíacas por la manipulación traqueal. Todos los procedimientos se realizaron en condiciones de esterilidad sobre mesa térmica y con los animales respirando espontáneamente con aporte de oxígeno por mascarilla, con una fracción inspiratoria de oxígeno de 1. Se practicó una incisión cervical anterior mediana (previas asepsia y anestesia local con lidocaína al 2%) y se procedió al abordaje de la tráquea extratorácica. En los 3 grupos sometidos a obstrucción de la vía aérea se colocó una banda de polietileno (4×8mm) alrededor de la tráquea, entre el tercer y sexto anillos cartilaginosos. Se midió la presión esofágica, como medida indirecta de la presión pleural, con un catéter de polietileno lleno de agua colocado en el tercio inferior del esófago y conectado a un transductor de presión (9731 P23BC, Statham, Hato Rey, Puerto Rico). La banda de polietileno se ajustó hasta que la presión esofágica inspiratoria en esfuerzos ventilatorios a volumen corriente fuera un 50% mayor del valor basal. De esta forma se obtuvo un aumento significativo de las resistencias de la vía aérea, tal como puede observarse en diferentes situaciones patológicas, tales como las agudizaciones graves del asma, la EPOC o la apnea obstructiva del sueño. En el grupo control se disecó la tráquea y se midió la presión esofágica, tras lo cual se procedió a cerrar la incisión quirúrgica. A los animales del grupo OT+salbutamol crónico se les implantó, de forma subcutánea en la región interescapular, una minibomba de liberación osmótica (Alzet modelo 2001, San Diego, CA, EE.UU.) para asegurar una infusión continua de salbutamol de 1mg/kg/día. Esta dosis se ha considerado clínicamente relevante en estudios experimentales18. Todos los animales se recuperaron de la anestesia sobre la mesa térmica, con aporte de oxígeno, en un plazo de 30min, tras lo cual permanecieron en jaulas individuales con agua y comida ad libítum durante 7 días. Pasado ese período se anestesió de nuevo a las ratas con la misma técnica y se abordó la región cervical anterior para colocar un catéter en la arteria carótida izquierda. En el grupo OT+salbutamol agudo se administró salbutamol a dosis de 25μg/kg por vía intravenosa15. Pasados 5min de estabilización se tomaron las muestras de sangre para gasometría arterial y se procedió a la eutanasia mediante exanguinación.
Propiedades contráctilesPara el estudio de la fuerza muscular diafragmática se extrajeron tiras de tejido del hemidiafragma izquierdo de entre 3 y 5mm de ancho, y se conservaron las inserciones costal y tendinosa. El diafragma se conservó en solución de Krebs-Ringer bicarbonato —pH=7,40±0,02; contenido (mM): glucosa, 11,5; NaCl, 138; KCl, 5,9; CaCl2, 1,4; MgSO4, 0,9; NaH2PO4, 1,2; NaHCO3, 25— a 37°C y una mezcla del 95% de oxígeno y el 5% de anhídrido carbónico para oxigenar y mantener el pH de la solución. Los fragmentos diafragmáticos se colocaron en un dispositivo diseñado para medir la fuerza muscular (Myobath-2, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, EE.UU.), bajo perfusión de baño (Krebs-Ringer bicarbonato en iguales condiciones), con control termostático de temperatura a 37°C y flujo continuo que permite el recambio completo del baño cada 15min. En el grupo OT+salbutamol agudo se agregó salbutamol al baño a una concentración de 20μg/l. Este valor se corresponde con las concentraciones plasmáticas alcanzadas en humanos después de una dosis oral de 4mg de salbutamol15. Las tiras musculares se colocaron verticalmente, con el extremo tendinoso hacia arriba ajustado a un transductor de tensión (Fort 100, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, EE.UU.) y montado en un soporte móvil para el registro de la tensión muscular. Las señales se adquirieron con un amplificador (TBM4M, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, EE.UU.) y un sistema computarizado para adquisición y procesamiento de señales (Anadat 5.2, RHT-InfoDat Inc., Montreal, Quebec, Canadá). Las fibras musculares se estimularon de forma indirecta a través de 2 electrodos de platino situados a ambos lados de las mismas (Somatosensory Stimulator S10DSCMA, Grass Instrument Co., Quincy, MA, EE.UU.).
Una vez colocadas las tiras en el sistema de registro, se determinaron el voltaje máximo de estimulación y la relación fuerza-longitud óptima (Lo). La fuerza muscular se estudió para todos los estímulos con Lo y voltaje supramáximo. Después de un período de 15min de estabilización, se aplicaron estímulos eléctricos aislados para estudiar la contracción simple. Las características de ésta se evaluaron midiendo el pico de tensión máxima de la contracción (Tmáx), el tiempo de contracción (TC, tiempo al pico de tensión) y el tiempo de relajación media (TR1/2), definido como aquel en que la Tmáx alcanzada cae a la mitad de su valor. También se analizaron la relación dT/dtmáx (máxima pendiente de ascenso del Tmáx) y −dT/dtmáx (máxima pendiente de descenso del Tmáx) como parámetros de velocidad de contracción y relajación, respectivamente. Con posterioridad se aplicó una serie de estimulaciones tetánicas a frecuencias de 10, 20, 50 y 100Hz, con trenes de estímulo de 1s de duración y con un intervalo de 5s entre cada uno de ellos para construir la curva fuerza-frecuencia.
Finalizado el protocolo de estimulación, se midieron la longitud y el peso de la tira diafragmática para Lo. El área de sección transversal del músculo se estimó con la siguiente fórmula: área de sección transversal=masa músculo (g)/Lo (cm) ×1,056 (g/cm3). El valor 1,056 corresponde a la densidad del músculo expresada en g/cm3. El área de sección transversal se utilizó entonces para calcular la tensión —es decir, la relación fuerza/área— de cada segmento muscular, expresada en N/cm2.
Análisis estadísticoTodas las variables analizadas mostraron una distribución normal. Se realizó el test de homogeneidad de Levene, que mostró varianzas sin diferencias entre los grupos. Las curvas fuerza-frecuencia se compararon por análisis de la varianza para medidas repetidas, mientras que el análisis de la contracción simple y de los parámetros gasométricos se realizó por ANOVA de una vía. Posteriormente se llevó a cabo un análisis post hoc (Student-Newman-Keuls) para determinar la diferencia entre los distintos grupos. Los datos se expresaron como media±error estándar. Los resultados se consideraron significativos cuando el valor de p<0,05. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS versión 11.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.).
ResultadosParámetros gasométricosLos 3 grupos de animales sometidos a OT presentaron una disminución del pH y un aumento de la presión arterial de anhídrido carbónico, de la concentración arterial de bicarbonato y del exceso de bases en sangre arterial, en comparación con los animales sin obstrucción extrínseca de la vía aérea (p<0,05). El valor de exceso de bases en el grupo OT+salbutamol crónico fue mayor que en los otros grupos (p<0,05). No hubo diferencias estadísticamente significativas en los valores de presión arterial de oxígeno entre los 4 grupos. En la tabla 1 se detallan los valores gasométricos obtenidos en los diferentes grupos.
Análisis de gases sanguíneos y del equilibrio ácido-base
| Control | OT | OT+SLB agudo | OT+SLB crónico | |
| pH | 7,35±0,02a | 7,12±0,06 | 7,09±0,06 | 7,15±0,04 |
| PaO2 (torr) | 231±36 | 350±30 | 316±34 | 273±70 |
| PaCO2 (torr) | 51,4±3,3a | 127,5±20,1 | 140,8±18,7 | 134,4±18,1 |
| HCO3− (mEq/l) | 27,2±0,6a | 37,2±1,3 | 38,0±1,5 | 38,1±1,9 |
| EB (mEq/l) | 2,1±0,5a | 7,8±1,8 | 9,4±1,4 | 14,1±1,9b |
EB: exceso de bases; HCO3−: concentración arterial de bicarbonato; OT: obstrucción traqueal; PaCO2: presión parcial arterial de anhídrido carbónico; PaO2: presión parcial arterial de oxígeno; SLB: salbutamol.
Datos expresados en media±error estándar.
Como se observa en la tabla 2, los animales sometidos a OT extrínseca sin tratamiento adicional (grupo OT) presentaron una reducción significativa del Tmáx y de dT/dtmáx respecto al grupo control (p<0,05). La administración de salbutamol tanto aguda como crónica determinó una mejoría significativa de dichos parámetros cuando se comparó con el grupo OT (p<0,05). La −dT/dtmáx del grupo OT+salbutamol crónico fue significativamente mayor que la del grupo OT (p<0,05). En el análisis de las curvas fuerza-frecuencia (fig. 1) se objetivó un descenso de la fuerza diafragmática en el grupo OT con respecto al grupo control (p<0,05). Los grupos OT+salbutamol agudo y OT+salbutamol crónico presentaron una mejora significativa de la fuerza diafragmática comparados con el grupo OT (p<0,05), y mostraron valores comparables a los del grupo control.
Análisis de los parámetros de la contracción simple
| Control | OT | OT+SLB agudo | OT+SLB crónico | |
| Tmáx (N/cm2) | 6,46±0,90 | 3,28±0,55a | 6,18±0,71 | 7,09±0,59 |
| TC (ms) | 30,0±2,1 | 27,0±1,5 | 27,0±1,7 | 30,7±1,7 |
| TR1/2 (ms) | 30,0±3,0 | 27,8±3,6 | 27,5±1,8 | 28,2±1,6 |
| dT/dtmáx (N·s/cm2) | 818,3±98,4 | 368,4±40,7a | 807,5±102,3 | 1007,3±155,8 |
| −dT/dtmáx (N·s/cm2) | 408,3±72,0 | 206,7±18,7 | 411,3±62,9 | 481,0±83,4b |
dT/dtmáx: velocidad de contracción; −dT/dtmáx: velocidad de relajación; OT: obstrucción traqueal; SLB: salbutamol; TC: tiempo de contracción; Tmáx: tensión máxima de la contracción; TR1/2: tiempo de relajación media.
Datos expresados en media±error estándar.
El modelo de compresión traqueal extrínseca durante 7 días determina una obstrucción crónica de la vía aérea que reproduce las alteraciones diafragmáticas histológicas, bioquímicas y contráctiles observadas en la EPOC3–5,19. La alteración de la contracción muscular se objetivó básicamente por los valores de Tmáx, dT/dtmáx y el deterioro de la curva fuerza-frecuencia del grupo OT2,4. Sin embargo, hemos demostrado que estas alteraciones pueden prevenirse o revertirse farmacológicamente. Los agentes adrenérgicos β2 se utilizan a menudo en las enfermedades con limitación al flujo aéreo para mejorar las condiciones de carga de los músculos respiratorios, principalmente por sus efectos broncodilatadores. En nuestro modelo experimental, donde la obstrucción de la vía aérea es crónica e irreversible, la administración de salbutamol se asoció con una mejoría significativa de las propiedades contráctiles del diafragma in vitro. Este resultado se produjo en los 2 grupos tratados con salbutamol, tanto tras la administración aguda como en los animales que lo recibieron de forma crónica y continua a lo largo de toda la duración del modelo. Sin embargo, todos los animales con OT presentaron hipercapnia con acidosis respiratoria crónica, cuya evolución fue independiente de que hubieran recibido el fármaco, lo que demuestra la intensidad y persistencia de la carga resistiva. Esta alteración del intercambio gaseoso se debe probablemente a más de un mecanismo, y debe de estar vinculada sobre todo al acusado aumento de la carga resistiva, con el consecuente incremento del trabajo respiratorio y desarrollo de fatiga muscular. Respecto a la oxigenación arterial, otros autores han demostrado que el modelo de OT extrínseca cursa con hipoxemia durante la ventilación espontánea al aire3,5,19. Si bien la utilización de una fracción inspiratoria de oxígeno de 1 podría favorecer la producción de atelectasias secundarias a desnitrogenación, esto no se tradujo en cambios significativos de la presión arterial de oxígeno en los distintos grupos de estudio.
En cuanto a los posibles mecanismos involucrados en la disfunción muscular, es necesario mencionar que la propia hipercapnia puede contribuir al deterioro contráctil12,20. Este hecho se ha mencionado como uno de los determinantes de la disfunción muscular en la EPOC21. Estudios in vitro en condiciones de hipoxia e hipercapnia han demostrado que las alteraciones de la contractilidad pueden revertirse con salmeterol22. En nuestro estudio, la hipercapnia pudo haber contribuido a un mayor deterioro de la fuerza muscular en el grupo OT. Sin embargo, de forma similar a lo observado en el trabajo mencionado, se logró una mejoría contráctil con la administración de salbutamol.
Por otra parte, se ha comunicado un aumento del infiltrado inflamatorio y de producción de citocinas proinflamatorias en el diafragma frente a sobrecargas mecánicas3,23. Se ha observado, por ejemplo, que el factor de necrosis tumoral alfa disminuye la contractilidad diafragmática in vitro24. En modelos como el nuestro, también se ha observado una asociación entre la disminución de la fuerza diafragmática y la oxidación proteica mediada por especies reactivas de oxígeno4. En este sentido, Barreiro et al comunicaron que en pacientes con EPOC se observa un incremento de la oxidación proteica en el diafragma que se relaciona con la gravedad de la obstrucción de la vía aérea9. Estudios realizados en diafragmas de afectados de EPOC han comprobado una disminución de la contractilidad in vitro, menor contenido de cadenas pesadas de miosina por fibra muscular y aumento de la actividad del complejo ubicuitina-proteasoma, comparados con sujetos control10,11.
Si bien se ha demostrado previamente que diversos fármacos adrenérgicos β2 incrementan la fuerza diafragmática in vitro tanto en situación basal como en diversas situaciones patológicas13–16,22, en nuestro conocimiento éste es el primer trabajo que demuestra que el salbutamol mejora la contractilidad diafragmática en un modelo de obstrucción crónica de la vía aérea. Se ha referido que el efecto inotrópico del salbutamol se asocia a aumento de las concentraciones de adenosinmonofosfato cíclico y salida de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico, mejorando el acoplamiento excitación-contracción14,15. Podemos conjeturar que nuestros resultados se explican básicamente por este mecanismo, posible tanto en el modelo agudo como en el crónico. Con la administración crónica de salbutamol podrían desarrollarse otros mecanismos de protección muscular. En este sentido, se ha demostrado que el salbutamol disminuye la producción de citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa25,26 y tiene efectos antioxidantes in vitro, con capacidad de actuar como atrapador de radicales libres y disminuir la producción de especies reactivas de oxígeno27–29. Por otra parte, se ha identificado un efecto anabólico del salbutamol18. Los fármacos agonistas β2 han mostrado cierta capacidad de disminuir la actividad del complejo ubicuitina-proteasoma, inhibiendo el catabolismo proteico que se asocia a la sobrecarga mecánica30–32. A partir de estos conocimientos también conjeturamos que, si bien la administración crónica de salbutamol pudo haber contribuido a mejorar la función muscular por estímulo anabólico y por disminución de la actividad proteolítica, estos mecanismos tendrían poca posibilidad de desarrollo en el modelo agudo.
En conclusión, nuestro trabajo demuestra que el salbutamol mejora la pérdida de la contractilidad diafragmática determinada por la sobrecarga resistiva crónica sobre los músculos respiratorios. Los mecanismos responsables tanto de la disfunción diafragmática como de la recuperación asociada al uso de salbutamol son múltiples y deberán estudiarse con mayor profundidad.
Los autores agradecen al Dr. José Boggia su permanente dedicación y apoyo, sin los cuales no hubiera sido posible realizar este trabajo.
Financiación
Investigación parcialmente financiada por la Comisión Sectorial de Investigación Científica, Universidad de la República, y por GlaxoSmithKline a través de la Ley de Fundaciones, Universidad de la República.
