El comité de investigación del Huashan Hospital afiliado a la Fudan University aprobó el estudio y todos los individuos proporcionaron su consentimiento informado por escrito a la participación. Seleccionamos un total de 40 adultos, de 21–58 años de edad (22 hombres y 18 mujeres). Se distribuyeron en 4 grupos (10 por grupo) en función de su estado de salud respiratoria.

El grupo A incluyó a individuos sanos; el grupo B incluyó a individuos con una infección vírica de las vías respiratorias superiores, por lo demás sanos; el grupo C incluyó a individuos con asma leve o moderada, controlada; el grupo D incluyó a individuos con asma leve o moderada, controlada, e infección vírica de las vías respiratorias superiores.

Para todos los grupos, los criterios de exclusión incluyeron lo siguiente: antecedentes de cardiopatías graves, hipertensión arterial, bronquitis crónica, glaucoma, hipertrofia prostática, tiroidopatías, diabetes, anemia o insuficiencia hepática y renal. También se excluyó a las mujeres embarazadas o en período de lactancia. Otros criterios de inclusión/exclusión para cada uno de los 4 grupos fueron los siguientes: en los grupos A y B los individuos no tenían antecedentes de enfermedades alérgicas o inmunológicas, no habían recibido una vacuna vírica durante los 12 últimos meses y no habían participado en un ensayo clínico de un fármaco durante los 3 últimos meses; en el grupo B se incluyó a individuos con un diagnóstico de infección vírica aguda de las vías respiratorias superiores, en función de los signos, síntomas, pruebas de laboratorio sistemáticas y exámenes de detección vírica; en el grupo B se excluyó a los individuos con sospecha de infección bacteriana de acuerdo con los signos, síntomas y pruebas de laboratorio. Como ejemplo, los recuentos de leucocitos eran, como mínimo, de 10,0×109/l, o la proporción de neutrófilos era como mínimo del 80% (mayor que el valor de referencia) o la radiografía de tórax indicaba neumonía, incluida la vírica. Todos los individuos de los grupos A y B formaban parte del personal del Huashan Hospital afiliado a la Fudan University, en Shangai, China. Los grupos C y D eran pacientes ambulatorios asmáticos, seguidos en el Huashan Hospital afiliado a la Fudan University. En los pacientes se había establecido el diagnóstico de asma en función de los criterios desarrollados por la Chinese Society of Respiratory Diseases, clasificada como leve o moderada. Los pacientes recibían tratamiento con regularidad con una pauta establecida por la GINA; se los trataba con budesonida inhalada (Turbuhaler®) (100–400μg) como tratamiento de mantenimiento y se encontraban en remisión. Los pacientes del grupo C y D no habían recibido una vacuna vírica durante los 12 últimos meses y no habían participado en un ensayo clínico de un fármaco durante los 3 meses previos. En los pacientes del grupo B también se estableció el diagnóstico de infección vírica aguda de las vías respiratorias superiores de acuerdo con los signos, síntomas, pruebas de laboratorio sistemáticas y detección de virus. Los pacientes del grupo D se excluyeron si se sospechó una infección bacteriana de acuerdo con los signos, síntomas y pruebas de laboratorio. Los pacientes de este grupo también se excluyeron si los síntomas se deterioraron tras la infección de las vías respiratorias superiores y no pudo efectuarse la inducción del esputo.

Se indicó a los individuos que debían acudir al hospital al cabo de 24h, tan pronto como manifestaran signos de infección vírica de las vías respiratorias superiores. Todos estuvieron de acuerdo en que se les realizaran pruebas de laboratorio sistemáticas y una radiografía de tórax. Se siguió a todos los individuos durante 7 días; el esputo se indujo a diario y las puntuaciones de síntomas de infección vírica de las vías respiratorias superiores y de asma se registraron a diario.

• 1.

  Manifestaciones clínicas: los pacientes contrajeron un resfriado y presentaban fiebre, escalofríos, sudación, malestar, faringitis, rinitis, congestión nasal, estornudos, cefaleas, mal estado general y artralgia. La exploración física indicó eritema e inflamación faríngeos y la auscultación pulmonar no detectó estertores húmedos y secos.

• 2.

  Pruebas de laboratorio: hemograma sistemático, recuento de leucocitos inferior o igual a 10,0×109/l o neutrófilos inferior o igual al 80% (o no superior al valor de referencia).

• 3.

  Exploración por imágenes: la radiografía de tórax no indicó una condensación pulmonar o signos de infección. Se excluyeron las lesiones antiguas.

Los síntomas de infección vírica respiratoria se puntuaron del modo siguiente: 1, leves; 2, moderados, y 3, graves. En la tabla 1 se muestran los criterios usados para asignar estas puntuaciones. El diagnóstico, el grado y el tratamiento del asma siguieron los criterios GINA13. La tabla 2 muestra los criterios usados para asignar las puntuaciones de síntomas de asma.

El esputo se indujo entre las 8–10 de la mañana a diario durante 7 días, según lo descrito previamente14. En pocas palabras, después de una espirometría basal y un pretratamiento con salbutamol, los individuos inhalaron suero salino hipertónico al 3, al 4 y al 5% durante períodos de 7min. Después de cada período, trataron de expectorar esputo en contenedores de plástico.

Las muestras de esputo se vertieron en placas de Petri inmediatamente después de la inducción. Se seleccionaron los tapones de moco originados a partir de las vías respiratorias inferiores, se introdujeron en tubos de Eppendorf® y se añadieron 100ml de sulfóxido de dimetilo (Merck, Alemania). Los tubos se cerraron herméticamente, se agitaron durante 30s, se codificaron y se almacenaron en un congelador a −70°C.

Un asistente de laboratorio del turno de día procesó las muestras de esputo congelado mediante la utilización de un protocolo descrito previamente15, con ligeras modificaciones. Los tubos de Eppendorf se dejaron descongelar a temperatura ambiente y su contenido se pesó. Se añadió un volumen (μl) de solución de dithiothreitol (Sputolysin, Calbiochem Corp, La Jolla, California, EE. UU.) en una dilución de 1:10 con agua destilada igual a 4 veces el peso del esputo (en mg). Se homogeneizó agitando el mezclador y después se colocó el tubo en banco mecedor. Se añadió un volumen de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfatos igual al de la solución de dithiothreitol empleada, y la suspensión se filtró a través de una gasa. La viabilidad celular se evaluó mediante exclusión en azul de tripano. La suspensión de células se centrifugó y el sobrenadante se congeló a 70°C para la detección posterior de IL-4, IL-5 e IFN-γ.

En el primer día del inicio de los síntomas de infección vírica, para la detección de virus respiratorios se usó un equipo ELISA (Simcere, Nanjing, China) según las instrucciones del fabricante. El espectro vírico que pudo identificarse con este equipo fue de rinovirus, virus respiratorio sincitial, virus de la gripe, virus parainfluenza, adenovirus y coronavirus. Las concentraciones de IL-4, IL-5 e IFN-γ en el sobrenadante se determinaron mediante la utilización de equipos ELISA (Rapid BioLab, Calabasas, CA, EE. UU.). Los resultados se expresaron en pg/ml.

Debido al reducido tamaño de la muestra se utilizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para comparar los 4 grupos. Se determinaron las medias y las desviaciones estándares para la edad y los índices de los exámenes hematológicos. Las distribuciones por sexo (número, porcentaje) se compararon mediante la utilización de la prueba exacta de Fisher. Las citocinas se determinaron en repetidas ocasiones durante 7 días; se utilizó un modelo mixto lineal para probar las tendencias temporales y comparar los grupos. Para las citocinas y los cocientes IL-4/IFN-γ e IL-5/IFN-γ se calcularon las medias y las desviaciones estándares. Si una tendencia temporal o un efecto de grupo fue estadísticamente significativo (análisis posthoc), se utilizó una prueba de Tukey. Se estableció la significación estadística en un valor de p<0,05. Para los análisis se utilizó el programa estadístico SPSS (versión 15.0, SPSS Inc., Chicago, EE. UU.)

Se seleccionó un total de 40 individuos, de 21–58 años de edad, incluidos 22 hombres (55%) y 18 mujeres (45%). Según lo descrito en Métodos, se distribuyeron en 4 grupos (A, B, C o D) en función del estado de salud respiratoria (10/grupo). En la tabla 3 se resumen sus características basales. Al comparar los 4 grupos no hubo diferencias significativas para la edad, el sexo, el porcentaje de basófilos, el recuento de plaquetas, el recuento de hematíes o los valores de hemoglobina.

No obstante, se identificaron diferencias significativas en los 4 grupos para el recuento de leucocitos y la fórmula leucocitaria. En pacientes con infecciones de las vías respiratorias superiores (grupos B y D) se detectaron mayores recuentos de leucocitos, un aumento del porcentaje de eosinófilos, linfocitos y monocitos y menores porcentajes de neutrófilos que en los individuos sanos (grupo A) o los pacientes con asma sola (grupo C).

Para la detección de virus en las muestras de esputo inducido se utilizó un equipo ELISA. Como se esperaba, en las muestras de los grupos A y C no se detectaron virus. En el grupo B, en 5 individuos se identificó una infección por rinovirus, en 3 se identificó una infección por virus de la gripe y en 2 se identificó una infección por virus respiratorio sincitial. En el grupo D, en 6 individuos se identificó infección por rinovirus, en 3 se identificó infección por virus de la gripe y en uno se identificó infección por virus sincitial.

En la figura 1 se muestran las variaciones con el tiempo de las concentraciones de IL-4, IL-5 e IFN-γ en las muestras de esputo inducido. Para los valores de IL-4 (fig. 1A), en comparación con los individuos sanos (grupo A), en pacientes con asma sola (grupo C) o tanto con asma como con infección de las vías respiratorias superiores (grupo D) se identificaron valores más altos durante todo el período de observación. En pacientes con infección exclusiva de las vías respiratorias superiores (grupo B) los valores fueron similares a los de los individuos sanos (grupo A). Por lo que respecta a las tendencias temporales, en los grupos B y D los valores de IL-4 aumentaron en el día 2, y, acto seguido, disminuyeron después del día 5 (ambas p para la tendencia temporal inferiores a 0,001). Para el grupo C, los valores de IL-4 permanecieron estables antes del día 4, aumentaron significativamente el día 5, y, acto seguido, disminuyeron ligeramente hasta el día 7 (p=0,004). En el grupo A no se detectaron cambios significativos (p=0,759).

Figura 1.

Tendencias temporales de las citocinas en muestras de esputo inducido durante el período de observación de 7 días. A) Interleucina (IL) 4. B) IL-5. C) Interferón gamma. Grupo A, individuos sanos; grupo B, con infección vírica respiratoria pero, por lo demás, sanos; grupo C, con asma leve o moderada; grupo D, igual que C pero con infección vírica respiratoria (n=10 por grupo). Los resultados son medias±desviaciones estándares. Para analizar las tendencias temporales se usó un modelo mixto lineal. Cuando se encontró una tendencia temporal significativa, para los análisis posthoc se utilizó una prueba de Tukey. Leyendas: 1A) 1, IL-4 (pg/ml); 2, tiempo (días); 3, grupo A; 4, grupo B, 5, grupo C, y 6, grupo D; 1B) 1, IL-5 (pg/ml); 2, tiempo (días); 3, grupo A; 4, grupo B; 5, grupo C, y 6, grupo D; 1C) 1, interferón gamma (pg/ml); 2, tiempo (días); 3, grupo A; 4, grupo B; 5 grupo C, y 6, grupo D.

(0.27MB).

Para los valores de IL-5 (fig. 1B), tanto en el grupo C como en el grupo D, se identificaron valores mayores que en el grupo A antes del día 3, aunque la diferencia entre el grupo A y el C desapareció después del día 4. Los de los grupos A y C no cambiaron significativamente con el tiempo (ambas p>0,05). En comparación, para los grupos B y D, los valores aumentaron significativamente al cabo de 5 días, no se modificaron hasta el día 6 y, acto seguido, disminuyeron en el día 7 (p=0,06 para el grupo B y p<0,001 para el grupo D).

Para los valores de IFN-γ (fig. 1C), en el grupo C se demostraron valores más bajos que en el grupo A en los días 1 y 2, pero fueron similares después del día 3. Inicialmente, en el grupo D se identificaron valores más bajos que en el grupo A en el día 1; no obstante, en aquel grupo los valores fueron más altos que en el grupo A después del día 2, aunque las diferencias en los días 2 y 7 no fueron estadísticamente significativas. En los grupos A y C, una vez más, los valores no variaron significativamente durante el período de observación (ambas p>0,05).

Es interesante destacar que los valores de IFN-γ del grupo B alcanzaron un máximo el día 3 y, acto seguido, disminuyeron rápidamente; en el día 7 los valores fueron similares a los del día 1. En comparación, en el grupo D los valores máximos de IFN-γ se observaron en el día 5 y, acto seguido, disminuyeron en el día 7, cuando la concentración fue de 477,0pg/ml, similar a los valores del día 3.

También calculamos los cocientes que reflejan la proporción de citocinas Th2/Th1:IL-4/IFN-γ e IL-5/IFN-γ. En la tabla 4 se muestran los resultados diarios de estos cocientes. Para el grupo A, claro está, fueron significativamente más bajos que para el grupo C y D (todas las p<0,05). Por lo que respecta a las tendencias temporales, se identificaron variaciones significativas de los cocientes en los grupos B y D (p<0,001 para ambos grupos), aunque las tendencias temporales para IL-4/IFN-γ e IL-5/IFN-γ fueron algo diferentes.

En el grupo B el cociente IL-4/IFN-γ en el día 4 o más tarde fue significativamente mayor que los valores detectados el día 3 o previamente (p<0,001); el cociente IL-5/IFN-γ disminuyó ligeramente desde el día 1 al 3; acto seguido, aumentó significativamente desde el día 4 al 6, mientras que en los días 6 y 7 fue similar al del día 1 (p=0,001). En el grupo D, el cociente IL-4/IFN-γ aumentó significativamente después del día 3 (p<0,001); en los días 5 y 6 el cociente IL-5/IFN-γ fue significativamente más alto que en el día 1, pero en el día 7 no fue significativamente diferente del valor del día 1 (p=0,124).

Las puntuaciones de síntomas de infección vírica respiratoria (tabla 1) y de síntomas de asma (tabla 2) se registraron a diario para los 30 individuos de los grupos B, C y D, según fue apropiado. La tabla 5 muestra los resultados diarios de estas puntuaciones. Para las puntuaciones de asma, en el día 1, en el grupo D se observaron puntuaciones similares a las del grupo C. Sin embargo, las puntuaciones de asma aumentaron en el grupo D después del día 2, y alcanzaron un máximo en el día 4 (p<0,001). En el grupo D, comparado con el grupo C, se detectaron puntuaciones más altas de síntomas de asma para los días 2–7 (todas las p<0,05). Para el grupo D, las puntuaciones de síntomas de asma en los días 3, 6 y 7 fueron similares.

Para las puntuaciones de síntomas de las vías respiratorias superiores, en los grupos B y D se identificaron puntuaciones similares antes del día 4; después de este día, las puntuaciones del grupo B fueron significativamente más bajas que las del grupo D. Las puntuaciones máximas del grupo B se registraron el día 2 y, acto seguido, disminuyeron rápidamente hasta el día 7 (p<0,001). Las puntuaciones para el grupo D aumentaron rápidamente desde el día 1 al 4 y, a continuación, disminuyeron hasta el día 7 (p<0,001); las puntuaciones registradas en los días 6 y 7 fueron similares a las del día 2.