Se obtuvieron líneas celulares de pulmón humano normal CCD-19Lu y MRC-9, y líneas celulares de cáncer de pulmón humano A549 y HCC827 mediante el método de colección americana para cultivo tipo (ATCC). Las células se mantuvieron en un medio completo con RPMI-DMEM (Hyclone; GE Healthcare) de alto contenido en glucosa y un 10% de suero bovino fetal (FBS; Gibco), a 37¿C y en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO2. Todos los anticuerpos anti-FOXQ1 (ab194564), anti-TGF-β (ab9758), anti-Smad2/3 total (ab63672), anti-fosfo-Smad2/3 (ab63399), anti-E-cadherina (ab76055), anti-N-cadherina (ab18203), anti-vimentina (ab92547) y anti-GAPDH (ab181602) se adquirieron de Abcam. El hsa-miR-133 mirVana miRNA mimic (MC10029) y el control negativo mirVana miRNA (4464061) se adquirieron de Life Technologies. La transfección de las líneas celulares se efectuó siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, las células se incubaron durante 48h antes de realizar otras pruebas experimentales.

Las células se sembraron en placas de 6 pocillos con una densidad de 1×106 células/pocillo con 2 ml de medio DMEM completo. Transcurridas 24h desde la transfección del hsa-miR-133 o control negativo, se extrajo la proteína total utilizando un tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS e inhibidores de la proteasa). La concentración de proteínas se determinó mediante una prueba BCA. Cantidades iguales de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando una unidad de transferencia semiseca (Bio-Rad Laboratories). A continuación, la membrana se sumergió en un tampón bloqueador (PBS, 0,1% Tween-20) con leche desnatada al 5% durante 20min y luego se incubó con los anticuerpos primarios correspondientes durante toda la noche y a 4¿C. Después de los lavados con el tampón bloqueador, las células se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (Life Technologies) a temperatura ambiente durante 1h, se volvieron a lavar con el tampón bloqueador y se visualizaron con el sustrato Luminata Forte Western HRP (EMD Millipore).

Después de la transfección, se sembraron 1×105 células transfectadas con control miARN negativo o hsa-miR-133 en una placa con 6 pocillos. Con la punta de una pipeta estéril de 100μl se efectuó un daño lineal a través de la monocapa celular confluyente, y el detritus celular se eliminó lavándola con PBS. La distancia migrada del borde de crecimiento de las monocapas dañadas se determinó 24h después de causar el daño, y la tasa de migración se expresó como porcentaje respecto a los controles respectivos.

La prueba de invasión celular se llevó a cabo en una placa de 24 pocillos con cámara de relleno con un tamaño del poro de 8μm (BD Biosciences). Se colocaron 1×105 células transfectadas con control miARN negativo o hsa-miR-133 en la cámara superior de cada pocillo con membrana recubierta de Matrigel, diluidas en un medio de cultivo sin suero. El compartimento inferior se rellenó con 500μl de un medio que contenía un 10% de FBS para atraer a las células. Las células se incubaron a 37¿C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2 durante 24h, a lo que siguió una exposición a 20μM de 5-etinil-2-desoxiuridina (EdU) durante 4 h más y a 37¿C. Los insertos de membrana se retiraron de la placa y se tiñeron mediante el kit ENU (Invitrogen). Las células de cada pocillo se contaron en 6 campos microscópicos aleatorios, y la tasa de invasión se expresó como el porcentaje respecto a los controles respectivos.

Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos (1×105 células/pocillo). En resumen, para la prueba de fijación, tras 1h de incubación, las células no fijadas se lavaron 2 veces con PBS y las células fijadas se contabilizaron tras una tripsinización. La tasa de fijación se expresó como el porcentaje del número de células fijadas respecto al número total de células, y normalizado respecto al control correspondiente. Para la prueba de desprendimiento, las células se desprendieron con tripsina al 0,05% durante 3min, y se contabilizaron tras la incubación de las células sembradas durante 24h. Las células fijadas restantes se volvieron a tripsinizar con la enzima al 0,25% y se contabilizaron. La tasa de desprendimiento celular se expresó como el porcentaje de células desprendidas respecto del total de células, y normalizado respecto al control correspondiente.

Todos los valores se presentaron mediante la media ±EEM. Para establecer diferencias significativas entre grupos se utilizó la prueba de la t de Student bilateral. Se determinó que existían diferencias entre los datos si el valor de p era <0,05.

Mediante el recurso de microRNA.org, identificamos que la secuencia del miR-133 tiene un supuesto sitio de unión en el 3’-UTR del ARNm de FOXQ1. Además, mediante RT-PCR, tras un examen de su expresión en las líneas celulares de cáncer de pulmón humano A549 y HCC827, encontramos que la de miR-133 es significativamente más baja, en comparación con los niveles que se observan en las líneas celulares de pulmón normal CCD-19Lu y MRC-9. Las concentraciones de MiR-133 en CCD-19Lu y MRC-9 fueron similares, mientras que en A549 la concentración había disminuido hasta aproximadamente el 30% de las líneas celulares normales, y en HCC827 alrededor del 40% de las líneas celulares normales. Estos resultados sugirieron que, en comparación con las de las líneas celulares de pulmón humano normales, la expresión de miR-133 había disminuido significativamente en las líneas celulares de cáncer de pulmón.

A continuación validamos el supuesto sitio de unión del miR-133 en el 3’-UTR de FOXQ1 mediante una prueba de luciferasa. Las secuencias de 3’-UTR natural (WT-luc) del ARNm de FOXQ1 y su versión mutada (mut-luc) se fusionaron con el derivado de ORF luciferasa, respectivamente. Posteriormente, los 2 constructos de luciferasa se transfectaron por separado en células A549 y HCC827, junto con un control miARN negativo miR-133 mimic. Luego se evaluó la actividad de la luciferasa. Como consecuencia, el miR-133 redujo drásticamente la actividad del WT-luc hasta aproximadamente el 30% del valor obtenido en los experimentos de controles transfectados, de forma sistemática en las líneas celulares A549 y HCC827. Por otro lado, la actividad del mut-luc en gran medida no resultó afectada en las células transfectadas con miR-133 o con miARN de control. Por consiguiente, las secuencias complementarias del 3’-UTR FOXQ1 fueron una diana directa del miR-133.

Continuamos probando si el FOXQ1 era una diana in vivo del miR-133. El miR-133, y el control miARN negativo, fueron transfectados en células A549 y HCC827, que posteriormente se sometieron a RT-PCR para examinar las concentraciones de ARNm de FOXQ1. Los niveles de miR-133 en células A549 y HCC827 aumentaron de manera importante tras la transfección. En comparación con las transfecciones de ARNm de control, el miR-133 redujo significativamente los niveles del mensajero FOXQ1 en las 2 líneas celulares de cáncer de pulmón examinadas (fig. 1A), lo que indicó claramente que el ARNm de FOXQ1 es una diana buena del miR-133. Mediante un anticuerpo anti-FOXQ1, confirmamos que su nivel de proteínas también se encontraba marcadamente reducido en células transfectadas con miR-133 pero no en las transfectadas con control (fig. 1C).

Figura 1.

El FOXQ1 disminuye por la transfección del miR-133 en líneas celulares de cáncer de pulmón. A,B) Concentraciones relativas de ARNm FOXQ1 (A) y TGF-β (B) en líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con control miARN negativo o miR-133. C, D) Concentraciones de proteínas FOXQ1 (C) y TGF-β (D) en líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con control miARN negativo o miR-133. Como control de carga se empleó GAPDH. La cuantificación de la expresión de las proteínas FOXQ1 y TGF-β normalizadas a GAPDH también se muestra en los paneles inferiores. Los valores son medias ± EEM de 3 experimentos independientes.

** p < 0,01 frente al control respectivo.

(0.24MB).

Previamente, se había comunicado que el FOXQ1 podría promover la expresión del TGF-β16 y se había relacionado con la comunicación cruzada entre el TGF-β y las vías de señalización Wnt en la progresión del cáncer colorrectal7. Teníamos curiosidad por investigar si en el cáncer de pulmón también existía una correlación similar entre estos 2 genes. Resultó interesante comprobar que la disminución del FOXQ1 por transfección de miR-133 también redujo marcadamente la expresión del TGF-β en ambas líneas celulares de cáncer de pulmón (fig. 1B,D), lo que sugirió que es probable que tanto el FOXQ1 como el TGF-β participen en la génesis tumoral del cáncer de pulmón. Más importante todavía fue el hallazgo de que, en ambas líneas celulares de cáncer de pulmón (A549 y HCC827), la expresión miR-133 causó una inhibición significativa de la vía del TGF-β, indicada por una fosforilación reducida de la Smad2/3 (fig. 2A), ambos efectores derivados de la vía del TGF-β17. Cabe señalar que confirmamos de nuevo que la regulación de la vía del TGF-β por el miR-133 estaba mediada por el FOXQ1. Debido que en un experimento de cotransfección en el que se empleó el miR-133 y un plásmido que expresa el FOXQ1 sin su 3’-UTR, la concentración de TGF-β también aumentó después de la expresión del FOXQ1, incluso en presencia de miR-133 (fig. 2B-D).

Figura 2.

El miR-133 inhibe la vía del TGF-β, disminuyendo el FOXQ1 en líneas celulares de cáncer de pulmón. A) Concentraciones de proteína Smad2/3 totales y fosforiladas en líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con control miARN negativo o miR-133. Como control de carga se utilizó GAPDH. La cuantificación de la expresión de p-Smad2/3 normalizada a GAPDH también se muestra en los paneles inferiores. B-D) Concentraciones relativas de miR-133 (B), FOXQ1 ARNm (C) y TGF-β ARNm (D) en líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con miR-133 solo o cotransfección con miR-133 y FOXQ1 con expresión de plásmidos en ausencia de su 3’-UTR Los valores son medias ± EEM de 3 experimentos independientes.

* n.s.: no significativo frente al control respectivo.

** p < 0,01 frente al control respectivo.

(0.25MB).

El FOXQ1 se asoció a metástasis y a mal pronóstico del cáncer de pulmón8,9, por lo que la introducción de miR-133 para disminuir el FOXQ1 debería inhibir la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón. Para probar esta hipótesis, llevamos a cabo experimentos de curación de daños y de invasión celular en células A549 y HCC827 transfectadas con miR-133 y miARN de control. Tal como esperábamos, ambas líneas celulares exhibieron una tasa de migración significativamente reducida tras la transfección de miR-133, en comparación con los experimentos de control (fig. 3A,B). Además, en la prueba de invasión celular, el miR-133 también redujo sistemáticamente las tasas de invasión de ambas células A549 y HCC827, en comparación con los experimentos con transfección de control (fig. 3C,D). En su conjunto, estos resultados demuestran sólidamente el papel del miR-133 en la inhibición de la génesis tumoral del cáncer de pulmón.

Figura 3.

La expresión del MiR-133 inhibe la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón. A) Prueba de cicatrización de heridas con líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con control miARN negativo o miR-133. B) Las distancias de migración respecto al control en la prueba de cicatrización de heridas se determinaron 24h después del daño. C) Prueba de invasión celular con líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con control miARN negativo o miR-133. D) El número de células invadidas respecto al control se cuantificó 24h después de sembrar las células. Los valores son medias ± EEM de 3 experimentos independientes.

* p < 0,05 frente al control respectivo.

(0.37MB).

Mientras efectuábamos los experimentos de cicatrización de heridas y de invasión celular, observamos frecuentes cambios morfológicos en las células transfectadas con miR-133. Inicialmente, tanto las células A549 como las HCC827 mostraban una morfología alargada y fibroblastoide, pero después de la transfección de miR133 ambas líneas celulares tomaron una forma redondeada (fig. 4A), lo que sugirió una pérdida del fenotipo de la TEM. Durante la transición, las células epiteliales del tumor primario adquieren el fenotipo mesenquimatoso, lo que resulta en un mayor grado de invasión y metástasis, diseminándose a través de la circulación hasta alcanzar otros tejidos secundarios. Para confirmar esta observación, realizamos pruebas de fijación y desprendimiento celular en 2 líneas celulares de cáncer de pulmón transfectadas con un control miARN negativo o con miR-133. Como se muestra en la figura 4B,C, el miR-133 redujo significativamente las tasas de fijación y desprendimiento en ambos tipos de células A549 y HCC827, en comparación con las células transfectadas de control. Estos resultados indican la pérdida de las características de la TEM a nivel morfológico.

Figura 4.

La expresión del MiR-133 inhibe la transición epitelio-mesenquimatosa (TEM) de células de cáncer de pulmón. A) Morfología celular observada en líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con control miARN negativo o miR-133. B,C) Las pruebas de fijación (B) y despegue celular (C) se efectuaron en líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con control miARN negativo o miR-133. D) La expresión de los marcadores proteicos fenotípicos de la TEM se analizó en líneas celulares A549 y HCC827, tras transfección con control miARN negativo o miR-133. La cuantificación de las expresiones de proteínas normalizadas a GAPDH también se muestra en los paneles de la derecha. Los valores son medias ± EEM de 3 experimentos independientes.

* p < 0,05.

** p < 0,01 frente al control respectivo.

(0.29MB).

A nivel molecular, la TEM se caracteriza por una disminución del marcador epitelial E-cadherina y un aumento del marcador mesenquimatoso vimentina. Así, evaluamos si este cambio en los fenómenos de la TEM también podría observarse a nivel molecular. Como estaba previsto, el miR-133 elevó la expresión de la E-cadherina y redujo la expresión de la vimentina y N-cadherina, en comparación con las células transfectadas de control (fig. 4D), que demostraron una inversión clara del fenotipo de la TEM a nivel proteico.