Aunque la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza fundamentalmente por la afectación del parénquima pulmonar y las vías aéreas, en los últimos años se viene concediendo cada más importancia a sus aspectos sistémicos1, 2. Entre éstos destaca la disfunción muscular esquelética, que ocasiona importantes síntomas y condiciona el pronóstico1-3. Sin embargo, los diferentes músculos esqueléticos de los pacientes con EPOC presentan cambios fenotípicos que no son homogéneos4. Así, los músculos respiratorios muestran cambios que favorecen la actividad aeróbica5, mientras que los músculos de las extremidades sufren un proceso inverso6. A pesar de todo, algunos fenómenos parecen comunes a los diversos grupos musculares. Es el caso del estrés oxidativo7, 8 y del daño muscular9, 10.

Se conoce como daño muscular la lesión estructural provocada por una determinada noxa11, 12. En circunstancias normales, tras el daño se ponen en marcha los mecanismos de reparación y regeneración musculares13. El elemento celular fundamental de estos últimos fenómenos es la célula satélite, que se activa para fusionarse con las fibras musculares, a las que ceden su núcleo11. Dependiendo de variables ligadas al estímulo y a la integridad de los propios mecanismos reparativos, estos procesos pueden dar lugar a un músculo similar al original, o modificado (remodelación). En este sentido, modelos animales de enfermedad pulmonar inflamatoria han permitido observar que los músculos de las extremidades presentan una disminución en su capacidad regenerativa14, lo que podría explicar el fenotipo involutivo que se observa en los pacientes con EPOC. Nuestra hipótesis es que los músculos respiratorios de dichos pacientes, por el contrario, mantienen preservada su capacidad regenerativa, lo que facilita su adaptación fenotípica. Así pues, el obJetivo principal del presente trabaJo ha sido analizar el comportamiento de las células satélite en el músculo intercostal externo de pacientes con EPOC grave. Como objetivos secundarios, quisimos valorar el comportamiento de diversos marcadores moleculares de microlesión y reparación, así como su relación con las células satélite y el fenotipo final del músculo.

Valoración nutricional y de la función respiratoria. Para la valoración nutricional se determinaron parámetros biológicos y antropométricos. Por otro lado, se efectuó a todos los pacientes una evaluación convencional de la función respiratoria, que incluyó espirometría forzada (espirómetro Datospir 500, SIBEL, Barcelona, España), determinación de volúmenes pulmonares estáticos y resistencia de la vía aérea (equipo Masterlab, Jaeger, Würzburg, Alemania), así como de la capacidad de transferencia del monóxido de carbono (medidor de gases incorporado al citado Masterlab). En todos los casos se emplearon los valores de referencia para población mediterránea15-17. Por último, se determinaron los gases respiratorios en sangre arterial (analizador Rapidlab 860, Bayer, Chiron Diagnostics, GMBH, Tuttlingen, Alemania).

Valoración de la función muscular. Se realizó mediante la determinación de las presiones estáticas máximas en boca, según el método estándar previamente publicado18, empleando valores de referencia para población mediterránea19. Además se realizó el estudio de la resistencia de los músculos inspiratorios según el método ya descrito por nuestro grupo18. Por último, se obtuvo la fuerza prensil de la mano no dominante utilizando la maniobra clásica con un dinamómetro específico (Biopac Systems, Goleta, CA, EE.UU,) conectado a un polígrafo digital (Biopac Systems). Se tomó el valor máximo de 3 maniobras consecutivas válidas y reproducibles.

Obtención de las biopsias musculares y procesamiento de las muestras. Las muestras del músculo intercostal externo se obtuvieron del quinto espacio intercostal, permutando aleatoriamente el costado, según la técnica descrita por nuestro grupo18. Las muestras musculares se dividieron en diversas porciones inmediatamente después de su extracción. Un fragmento se fijó en formaldehído y se incluyó en parafina; fue el que se utilizó para las técnicas inmunohistoquímicas de tipificación fibrilar, según el procedimiento habitual de nuestro laboratorio18. La segunda porción muscular se procesó de forma estándar para el análisis ultraestructural, según procedimiento ya publicado9. Los criterios de identificación de las células satélite por microscopia electrónica fueron: a) separación entre la célula y la fibra muscular adyacente por una membrana plasmática; b) existencia de una lámina basal continua entre las células satélite y la fibra muscular, y c) núcleo de apariencia heterocromática20. Los resultados se han expresado como porcentaje de células satélite sobre el total de núcleos de fibras musculares en un área determinada21.

La tercera porción se colocó inmediatamente en un criovial, se congeló en nitrógeno líquido y se conservó a −70°C hasta su procesamiento para la identificación de transcriptomas -ARN mensajero (ARNm)- clave en la detección de microlesión celular y en los procesos de reparación y fenotipo fibrilares. Se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, según procedimiento ya publicado22, y se analizaron los transcriptomas correspondientes a las isoformas adultas (I, IIa y IIx, todas ellas directamente involucradas en el fenotipo fibrilar) y no adultas (perinatal y embrionaria, indicadoras de estrés/microlesión celular) de las cadenas pesadas de miosina (MyHC), así como a marcadores de células satélite (Pax-7 y m-caderina, correspondientes, respectivamente, a población y activación celular) y factores de crecimiento mecánico y similar a la insulina de tipo 1, (MGF y IGF-1, respectivamente, también indicativos de estrés/microlesión fibrilar e inicio de regeneración muscular).

En el presente trabajo se ha observado que los músculos intercostales de los pacientes con EPOC grave muestran hallazgos indicativos de microlesión celular, junto con una activación de sus células satélite, cuyo número se halla conservado o incluso ligeramente aumentado. Estos fenómenos parecen relacionados con el grado de afectación funcional de los pacientes y podrían explicar la presencia de un fenotipo fibrilar que no evidencia signos involutivos.

Los músculos respiratorios de los pacientes con EPOC muestran un grado incrementado de lesión estructural. Éste parece debido, al menos en parte, al sobreesfuerzo ventilatorio9, 22, aunque también podrían estar implicados otros factores, como el estrés oxidativo y la inflamación local7, 22. Sin embargo, los músculos respiratorios presentan simultáneamente un fenotipo modificado, que facilitaría su acción ventilatoria5, 19. Modelos animales parecen demostrar que ambos fenómenos, el daño y la remodelación, se hallan directamente ligados a través de mecanismos de reparación muscular13, 23, 24. Las células satélite son un elemento esencial en dicho proceso, aunque hasta la fecha no tenemos noticia de que se haya evaluado en pacientes con EPOC ni en modelos animales de la enfermedad.

En el presente trabajo se ha demostrado, por una parte, el aumento de marcadores moleculares que apuntan fuertemente a la presencia de microlesión estructural en los músculos intercostales de los pacientes. El uso de dichos marcadores permite detectar fenómenos más sutiles que pueden pasar inadvertidos con las técnicas morfométricas convencionales. Así, tanto los transcriptomas de las isoformas no adultas de las MyHC como los de determinados factores de crecimiento se expresan en situaciones de estrés muscular extremo y microlesiones13, 25, 26. Nuestros hallazgos muestran también que la expresión de algunas de estas moléculas se relaciona con el grado de afectación funcional respiratoria. Todo ello concuerda con trabajos precedentes que utilizando técnicas complementarias han podido demostrar daño estructural en el músculo intercostal de pacientes con EPOC22. Por otra parte, el IGF-1 y su variante genética, el MGF, también intervienen directamente en los estadios iniciales de la regeneración muscular estimulando la diferenciación y proliferación de las propias células satélite27.

Este trabajo muestra asimismo que la población de células satélite está conservada o ligeramente aumentada (dependiendo de la variable analizada) en el intercostal de los pacientes con EPOC, con un grado de activación significativamente superior al de los sujetos sanos. Las células satélite se localizan entre la membrana basal y el sarcolema de las miofibras28, 29, y son responsables del crecimiento, la reparación y el mantenimiento del músculo esquelético29. Su población permanece relativamente estable durante la vida adulta30, debido a su capacidad para autorrenovarse29, 30. Con el envejecimiento, sin embargo, su porcentaje disminuye, lo que se reflejará en la menor capacidad de regeneración del músculo del anciano31. Cuando se produce una lesión, las células satélite se activan, pasando a proliferar, diferenciarse y fusionarse con las fibras musculares. La inmensa mayoría de las células satélite se halla activada a las 24h de producirse una lesión20, aunque este período activo es relativamente corto (unas 120h)32. Esto último dificulta su detección, salvo en condiciones experimentales o cuando el estímulo sea continuado (como probablemente sea el caso de nuestros pacientes). El hecho de que el grado de deterioro de la función pulmonar se haya asociado a la densidad de células satélite en nuestro estudio indica un papel modulador para la sobrecarga mecánica.

Aunque sólo disponemos de una observación transversal, el resultado final del proceso de microlesión y reparación que se evidencia en el presente estudio parece haber sido el apropiado, ya que los intercostales de los pacientes muestran un fenotipo fibrilar conservado. Trabajos precedentes, realizados con series más amplias, han demostrado ocasionalmente un incremento de la proporción de fibras de tipo II (sobre todo IIa)33, lo que podría estar relacionado con la sobreexpresión del gen homónimo evidenciado en el presente estudio. La activación de este gen podría responder a las demandas puntuales y de alta intensidad sobre el músculo (esfuerzo, agudizaciones), que simularían un entrenamiento de tipo anaeróbico33.

Sin embargo, desde el punto de vista funcional la conservación del fenotipo muscular coexiste con la alteración de la fuerza y resistencia de los músculos inspiratorios. Probablemente esto se halle más en relación con factores de tipo mecánico (como parece indicar la relación entre función muscular respiratoria y función pulmonar) o sistémico (como apunta también la coexistencia de disfunción en los músculos espiratorios y de la mano).

Otra asociación interesante revelada en el presente trabajo es la observada entre la masa corporal y los marcadores de microlesión y reparación en los pacientes con EPOC. Esta asociación invita a pensar que estos fenómenos celulares pudieran estar en la base de la cantidad de masa muscular de un paciente. Esta hipótesis debería analizarse en futuros trabajos.

El interés clínico de este estudio radica en sus eventuales implicaciones en el tratamiento rehabilitador. Aunque los músculos intercostales parecen lesionarse con facilidad, si mantienen su capacidad reparadora en los pacientes con EPOC es posible plantear la realización de ejercicios ventilatorios de alta intensidad para mejorar su fenotipo. Ahora sería necesario disponer de datos sobre el proceso de regeneración en los músculos de las extremidades, cuyo fenotipo presenta rasgos involutivos y cuya respuesta ante ejercicios de alta intensidad es controvertida.

El principal músculo respiratorio en sujetos sanos es el diafragma. Sin embargo, la obtención de muestras válidas se halla limitada por el escaso número de candidatos y por la presencia sistemática en ellos de comorbilidad relevante. La opción escogida en el presente trabajo, el intercostal externo, nos parece válida por diferentes razones. En primer lugar, permite seleccionar a los sujetos del estudio excluyendo cualquier comorbilidad relevante. En segundo lugar, el intercostal externo de los pacientes con EPOC muestra actividad ventilatoria incluso en reposo34, además de ser un músculo que participa progresivamente en el esfuerzo ventilatorio al incrementarse las cargas del sistema34, 35. Por tanto, este músculo expresaría no sólo el efecto de la actividad ventilatoria basal de los pacientes con EPOC, sino que además, como ya se ha dicho, podría reflejar los incrementos puntuales de dicha actividad.

En el presente trabajo se decidió complementar la evaluación morfométrica clásica28 con marcadores moleculares expresados específicamente por las células satélite, no por los mionúcleos o las propias fibras musculares. Así, el gen de Pax-7, un factor regulador de la miogenia, cuya activación es necesaria para la formación de células satélite, es un buen marcador de esta población celular36. Además, diferencia las células satélite de las denominadas "células madre pluripotenciales", que no lo expresan36. Por su parte, la m-caderina es una molécula de adhesión, cuya expresión aumenta en las células satélite activadas, por lo que se considera un buen marcador de este fenómeno36.

En conclusión, el presente trabajo demuestra que el músculo intercostal de los pacientes con EPOC grave mantiene una población estable de células satélite, cuya actividad se halla incrementada. Probablemente dicha activación y la expresión paralela de marcadores de regeneración respondan a la presencia de microlesión muscular. Dado que todo ello se acompaña de un fenotipo fibrilar conservado, nuestros resultados apuntan al éxito del proceso reparador en el músculo intercostal de estos pacientes.