Estudio prospectivo en el que se incluyeron pacientes consecutivos con diagnóstico o alta sospecha de carcinoma pulmonar no microcítio, en los que se realizó una punción citológica dirigida por USEB de adenopatías mediastínicas o hiliares con fin diagnóstico y/o de estadificación. La inclusión de los casos se realizó en nuestro comité multidisciplinar de CP siguiendo el protocolo de diagnóstico, estadificación y tratamiento del CP de nuestro centro (www.chuvi.es), que sigue las normativas y recomendaciones nacionales e internacionales actuales. Se incluyeron pacientes con adenopatías hiliares y/o mediastínicas de eje menor mayor de 1cm en la tomografía computarizada o de 5mm en caso de hipercaptación patológica en la tomografía por emisión de positrones-tomografía computarizada. Se excluyeron aquellos pacientes con muestra no valorable según el citólogo o con muestra insuficiente para estudios posteriores de metilación. Todos los procedimientos se realizaron en la Unidad de Técnicas Broncopleurales del Servicio de Neumología del CHUVI.

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios clínico-éticos del Gobierno de España y la Declaración de Helsinki, y fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes y se garantizó el anonimato.

Los procedimientos se realizaron de forma consecutiva entre septiembre de 2009 y diciembre de 2012, siendo la mayoría ambulatorios, en la sala de broncoscopias convencional, con monitorización ecocardiográfica, tensional y pulsioximétrica, y bajo sedación consciente con midazolam y fentanilo. Se utilizó un broncoscopio BF-UC180F-OL8 (Olympus, Tokio, Japón) y un ecógrafo Aloka ProSound Alpha 5 (Hitachi-Aloka, Tokio, Japón). Tras la exploración endoscópica se procedió a la medición de la lesión y a su punción utilizando agujas NA2015X-4022 (Olympus, Tokio, Japón), avanzando por el canal del ecobroncoscopio hasta la vía aérea, donde la aguja era extraída e insertada en el interior del ganglio a través de la pared traqueal y bronquial con control ultrasonográfico, y movilizada al interior del ganglio realizándose aspiración a jeringa de vacío. Se realizaron de uno a 3 pases por adenopatía en función de los resultados inmediatos obtenidos. Se recuperó el material obtenido, la muestra se fijó en alcohol y fue examinada inmediatamente por un citólogo, quien la identificó como: procedente de un ganglio normal (celularidad predominantemente linfoide sin atipia y/o material antracótico); ganglio con infiltración neoplásica (presencia de células neoplásicas y celularidad de ganglio); muestra no valorable (presencia únicamente de células sanguíneas o bronquiales). Una parte de las muestras verificada in situ como representativa se resuspendió en solución salina estéril e inmediatamente se congeló a −20°C para los posteriores estudios moleculares.

En aquellos casos en los que el resultado anatomopatológico no evidenció afectación neoplásica se hizo una comprobación del resultado negativo mediante cirugía torácica. En el caso de los pacientes en los que se decidió no realizar una confirmación quirúrgica, se realizó un seguimiento mediante revisión de la historia clínica durante un año. Si la adenopatía no experimentó crecimiento durante ese año se consideró como verdadero negativo8. Todos los casos dudosos se excluyeron del estudio.

El ADN se extrajo utilizando el kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.), adaptando el protocolo al volumen de cada muestra. El ADN se eluyó con 50μL de agua y se hicieron 2 alícuotas para posteriores tratamientos con bisulfito de sodio. La concentración de ADN se midió en un NanoDrop 2000c (Thermo Scientific). Las ratios de absorbancia 260/280nm permitieron estimar su pureza como: óptima (ratio 1,7-2,0), buena (ratio>2,0), o presencia de proteínas u otros contaminantes (ratio<1,7). El ADN se almacenó a −20°C hasta su uso.

Para llevar a cabo el análisis de metilación fue necesario tratar el ADN con bisulfito de sodio. Para ello empleamos el EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante, eluyendo con 20μL. El ADN modificado pasa a ser de cadena simple y rico en uracilo, resultando químicamente similar al ARN, por lo que su concentración se determinó como si se tratase de este ácido nucleico empleando el NanoDrop (Thermo Scientific). Las ratios 260/280nm permitieron estimar su pureza como: óptima (ratio 1,8-2,2), buena (ratio>2,2), o presencia de proteínas u otros contaminantes (ratio<1,8). El ADN tratado se almacenó a −80°C hasta el momento de su uso.

El análisis de metilación de los genes p16/INK4a y SHOX2 se realizó mediante PCR en tiempo real (qPCR) anidada específica para (MS) partiendo de 3μL de ADN tratado con bisulfito. En la primera ronda de amplificación se emplearon primers externos que amplificaron la isla CpG independientemente de su estado de metilación. Seguidamente se realizó una qPCR-MS diluyendo el producto de PCR y empleando sondas y cebadores específicos de metilación en un equipo StepOne (Applied Biosystems). La información más detallada de las secuencias utilizadas está disponible a petición del lector.

La pirosecuenciación se efectuó para los genes p16/INK4a y SHOX2. Se realizó una PCR con 3μL de ADN modificado utilizando cebadores diseñados con el software PyroMark Assay Design v2.0 (Qiagen). Seguidamente se realizó la secuenciación y cuantificación de la metilación empleando el cebador de pirosecuenciación en un PyroMark Q24 (Qiagen). Las islas CpG estudiadasfueron las mismas que se estudiaron por qPCR-MS. La información más detallada de las secuencias utilizadas está disponible a petición del lector.

Para los análisis estadísticos se utilizó el paquete SPSS (v19.0). Se emplearon pruebas bilaterales, y valores de p<0,05 se consideraron significativos. La concentración de ADN se expresó como mediana y rango intercuartil (RIC). La distribución normal y la homogeneidad de varianza se comprobaron con las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Levene, respectivamente. Los análisis no paramétricos para 2 muestras independientes se realizaron con la U de Mann-Whitney, mientras que para más de 2 muestras independientes se empleó la prueba de Kruskal-Wallis. Para analizar diferencias en datos pareados se utilizó la prueba de Wilcoxon. Las variables que se estudiaron fueron sexo, tipo de tumor, localización de las adenopatías, diagnóstico de la adenopatía, aspecto de la muestra ganglionar y concentración y pureza del ADN sin modificar y modificado con bisulfito de sodio.

La estimación del tamaño muestral necesario se ha realizado utilizando el programa Granmo 5.2 (Institut Municipal d’Investigació Médica, 1999), para muestras pareadas, aceptando un riesgo alfa de 0,05 y un riesgo beta de 0,20, asumiendo una prevalencia estimada de adenopatías malignas de un 70% y una diferencia mínima entre la sensibilidad y el valor predictivo negativo de las técnicas citohistológicas y las determinaciones moleculares del 15 y 10%, respectivamente. Se estimó que se precisan un mínimo de 79 casos para llevar a cabo el estudio.

Se incluyeron 88 pacientes, obteniéndose 170 muestras de estaciones ganglionares distintas por USEB-PTB, distribuidos de la siguiente manera: 38 pacientes con una muestra, 29 con 2 muestras, 13 con 3 muestras, 5 con 4 muestras, y 3 con 5 muestras. Setenta y cuatro pacientes (84%) eran varones, con una mediana de edad de 62,2 años (RIC: 51-73 años). En base a una escala colorimétrica propia, un 44,7% (n=76) de las muestras citológicas ganglionares mostró apariencia turbio-claro, un 38,2% (n=65) resultó poco sanguinolenta, y un 17,1% (n=29) fue muy sanguinolenta.

En un 86,5% de los casos (n=147) las punciones se realizaron en ganglios mediastínicos, mientras que el 13,5% (n=23) restante se realizó en ganglios hiliares. Las adenopatías más frecuentemente puncionadas fueron la 4R (39,4%; n=67) y la 7 (33,5%; n=57), seguida de la 4L (9,4%; n=16), 11L (7,1%; n=12), 11R (4,7%; n=8), 8 (2,4%; n=4), 2R (1,8%; n=3), 10R (1,2%; n=2) y 12R (0,6%; n=1). De acuerdo con el diagnóstico definitivo del ganglio, un 48,2% (n=82) fue benigno (no metastásico), mientras que el 51,8% (n=88) restante fue maligno (metastásico). Entre estos últimos, un 61,4% (n=54) fueron adenocarcinoma, un 31,8% (n=28) epidermoide y un 6,8% (n=6) de célula grande.

Se obtuvo un amplio rango de concentración de ADN de 4,10-1.103,00ng/μL (mediana: 42,75ng/μL; RIC: 22,48-100,13ng/μL). Para estudiar las características del ADN relacionamos su concentración con parámetros epidemiológicos y clínicos(tabla 1). Observamos que los varones muestran una mediana mayor, con diferencias significativas respecto a las mujeres (p=0,037). La concentración de ADN mostró diferencias en función del aspecto de las muestras citológicas, con valores mayores para muestras sanguinolentas, seguidas de las poco sanguinolentas, y por último, las de apariencia turbio-claro (p<0,001), conforme al contenido celular.

El protocolo empleado permitió extraer ADN de pureza óptima o buena (ratio 260/280nm) en un 61,18 y 8,24% de los casos, respectivamente. Las mayores concentraciones de ADN correspondieron a muestras de pureza óptima, seguidas de aquellas con contaminantes,y por último, las de pureza buena (p<0,001; tabla 1).

En relación con la estación ganglionar puncionada, no observamos diferencias en la concentración de ADN al comparar ganglios mediastínicos con hiliares (p=0,483), ni entre los ganglios mayoritarios 4R y 7 en relación con el resto (p=0,851). No se observaron diferencias en la concentración de ADN entre todas las adenopatías desglosadas en función de su localización. Sin embargo, las adenopatías 8 presentaron una mayor concentración de ADN en relación con las estaciones 4R, 11R y 11L (tabla 1). Para los grupos diagnósticos la concentración de ADN no siguió una distribución normal ni presentó homogeneidad de varianza, observándose medianas alrededor de 40ng/μL para las categorías benigno, adenocarcinoma y epidermoide, y de 138,4ng/μL para los 6 casos de célula grande (tabla 1). Consecuentemente, no se detectaron diferencias en la concentración de ADN en función del diagnóstico ganglionar (p=0,163)o entre adenopatías benignas y malignas (p=0,390).

Similarmente, se estudió la concentración de ADN modificado en relación con algunas variables(tabla 1). Se registraron concentraciones menores a las previas al tratamiento, con un rango de 0,20-392,30ng/μL (mediana: 19,13ng/μL; RIC: 7,60-60,18ng/μL). Al contrastar las concentraciones antes y después del tratamiento observamos diferencias significativas (p<0,001), con concentraciones disminuidas en el 93,53% de las muestras.

Aunque los varones siguieron mostrando mayores concentraciones de ADN que las mujeres, las diferencias no resultaron significativas (p=0,196). En relación con el aspecto de las muestras, las diferencias en la concentración de ADN modificado resultaron significativas (p<0,001). Por otra parte, la estimación de la pureza del ADN modificado indicó que el 63,53 y 26,47% son de calidad óptima o buena, respectivamente, totalizando un 90% los potencialmente adecuados para realizar el análisis de metilación. La mayor mediana correspondió a muestras de pureza óptima, al menos 3 veces superior a las muestras de purezas inferiores (p<0,001).

En relación con la estación ganglionar puncionada, como se observa en la tabla 1 no se detectaron diferencias entre las adenopatías mediastínicas e hiliares (p=0,512) ni entre las estaciones 4R y 7 respecto al resto (p=0,833). De manera similar a lo observado con la concentración de ADN antes del tratamiento, las diferencias observadas en el ADN modificado se presentaron entre las adenopatías 2R, 4R, 11R y 11L respecto a las 8 (tabla 1). Por último, no se encontraron diferencias al comparar las categorías de diagnóstico ganglionar (p=0,164) ni las adenopatías benignas y malignas (p=0,093) (tabla 1).

Aunque la mayoría de las muestras parecen adecuadas para estudios posteriores, para corroborar su validez se realizaron análisis de metilación para 2 genes supresores de tumor empleando 2 metodologías distintas. En la tabla 2 se resumen las características de las muestras en función de la obtención del dato de metilación (muestras con/sin dato de metilación), para ambos genes y los 2 abordajes.

Mediante la técnica de qPCR-MS no fueron posibles los análisis en el 9,41 (16/170; p16/INK4a) y 1,76% (3/170; SHOX2) de las muestras, mientras que por pirosecuenciación no se obtuvo información en un 1,26 (2/159; p16/INK4a) y 2,63% (1/38; SHOX2) de los casos. Las medianas y los RIC de la concentración de ADN antes y después del tratamiento resultaron considerablemente inferiores en las muestras sin dato de metilación en comparación con aquellas en las que sí fue posible el análisis. Esta diferencia resultó estadísticamente significativa (tabla 2), relacionándose con la dificultad en los análisis para ciertas muestras. Sin embargo, el porcentaje de muestras con pureza inadecuada se mostró muy variable tanto para las muestras sin dato de metilación como para aquellas con dato, aunque en las primeras resultó en todos los casos mayor, relacionándose también con la ausencia de resultados con las técnicas empleadas. En la figura 1 se muestran las curvas de amplificación de p16/INK4a mediante qPCR para una muestra válida y una no válida, mientras que los pirogramas de p16/INK4a para una muestra válida y una no válida se presentan en la figura 2.

Figura 1.

Curva de amplificación de p16/INK4a por qPCR-MS para una muestra válida (línea verde) y una muestra no válida (línea amarilla).

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Figura 2.

Pirogramas de p16/INK4a para una muestra válida (gráficas superiores) y una muestra no válida (gráficas inferiores). Como la pirosecuenciación se realizó en 2 reacciones distintas para abarcar los 18 sitios CpG de la isla, los pirogramas de la izquierda muestran los primeros 7 sitios CpG, mientras que los pirogramas de la derecha muestran los últimos 11 sitios CpG. Las barras grises de los pirogramas indican cada sitio CpG.

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