El estudio BIOMEPOC es de tipo prospectivo (que incluye la adquisición de numerosas variables y muestras biológicas en el momento del reclutamiento, pero también el seguimiento de algunas variables como la aparición posterior de cáncer de pulmón y mortalidad), con inclusión de pacientes procedentes en su mayor parte de un estudio previo y de controles sanos en los 7 centros participantes (Hospital Son Espases de Palma, Fundación Jiménez Díaz de Madrid, Hospital Clínic de Barcelona, Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla, Hospital 12 de Octubre de Madrid, Hospital del Mar de Barcelona y Hospital Universitari Parc Taulí de Sabadell). Se ha escogido un perfil de hospital terciario y universitario, acostumbrado tanto al manejo de pacientes complejos como de muestras biológicas que requieren manejo especializado. El proyecto consta de dos fases. La primera de ellas, de prospección y selección de biomarcadores, utilizando un subgrupo de pacientes y de controles sanos; y una segunda fase, de validación interna de los resultados ya obtenidos utilizando otro subgrupo de pacientes y de controles sanos (fig. 1).

Figura 1.

Esquema de desarrollo del proyecto BIOMEPOC. «Reserva» indica ulteriores análisis.

(0.16MB).

El planteamiento del proyecto no sería posible sin la disponibilidad de un grupo multicéntrico con amplia y larga experiencia en trabajos colaborativos realizados en red, así como de una cohorte de pacientes bien tipificados clínicamente. Afortunadamente existe un estudio de auditoría clínica denominado «Design and local implementation of Clinical Audits in different types of Obstructive Lung Disease» (DELICATO), promovido conjuntamente por el Área de Respiratorio del Centro de investigación en Red (CIBERES) y la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR), que incluye una cohorte apropiada para los objetivos del presente proyecto, y a la que se nos dio acceso.

Por tanto, los criterios de inclusión y exclusión de los pacientes fueron los mismos que en DELICATO. De forma breve, se estudiaron pacientes con EPOC2 y seguimiento continuado en una consulta especializada de neumología de al menos 2 años, a los que se añadieron controles sanos (seleccionados mediante cuestionario estandarizado y pruebas de función respiratoria dentro de la normalidad; con sexo y edad equilibrados con los de los pacientes), todos ellos mayores de 40 años. Los criterios diagnósticos para la EPOC fueron historia de hábito tabáquico, así como un cociente espirométrico porcentual posterior a la prueba broncodilatadora inferior al 70%2. El cálculo del tamaño muestral se realizó a partir de estudios previos18,26-28, tomándose el de mayor envergadura26 para el cálculo del número total de pacientes con EPOC, y ampliándolo generosamente en previsión de las pérdidas o dificultades de reclutamiento. Los otros estudios se utilizaron para el cálculo de muestras sanguíneas a valorar en los subanálisis empleando las distintas técnicas ya mencionadas. Esto supuso que cada uno de los 7 centros debía inicialmente intentar reclutar 90 pacientes con EPOC (unos 30 pacientes considerados «frágiles» según la definición adoptada en DELICATO: 3 o más contactos hospitalarios por exacerbación en el año precedente; y 60 enfermos más sin dicha condición) y 30 sujetos sanos. En todos ellos se extraería una muestra sanguínea para el estudio de biomarcadores, así como muestra espontánea de esputo para ulteriores estudios en aquellos pacientes en que esto fuese posible.

El estudio se diseñó atendiendo a los principios recogidos en la declaración de Helsinki, siendo aprobado por los Comités de Ética e Investigación Clínica (CEIC) de las diferentes instituciones. Todos los participantes en el estudio firmaron el correspondiente consentimiento informado tras haberles sido detallados los objetivos y procedimientos a emplear. Para garantizar el anonimato, se asignó a cada participante y a sus muestras un número correlativo de 4 cifras. El coordinador general del proyecto mantiene en archivo aparte y seguro la correspondencia entre dichas cifras y la identidad del sujeto.

Se recogió en una nueva base de datos centralizada, actualizándola, la información clínica, analítica, funcional y de seguimiento obtenida en el proyecto DELICATO. La presencia y severidad del enfisema se valoró a partir de la radiología convencional de tórax y la medición de la transferencia del CO, mientras que el estado nutricional se evaluó a través del valor del índice de masa corporal. A la mencionada base de datos se añadieron los correspondientes a los controles sanos.

Para la obtención de los biomarcadores se han utilizado diversas estrategias complementarias. En primer lugar, y para las técnicas convencionales en las que debían definirse previamente las moléculas a analizar, estas fueron seleccionadas a partir de la literatura especializada y un trabajo ya publicado por parte del grupo investigador utilizando la «minería de textos» (text mining)29. Por el contrario, y como ya se ha mencionado, no se estableció ninguna selección para las técnicas «ómicas» de screening amplio, evitando el potencial sesgo de una hipótesis predefinida.

Previo al inicio del proyecto se elaboró y distribuyó entre los participantes el protocolo estandarizado de recogida y procesamiento inicial de muestras (addendum 1). Estas fueron remitidas al centro coordinador y almacenadas a −80°C en su Biobanco (MARBiobanc). Dicha instalación cumple los criterios estandarizados de seguridad y calidad para la preservación y custodia de muestras biológicas (AENOR ER-0031/2012; UNE-EN ISO 90019). Las muestras serán procesadas con técnicas analíticas convencionales y análisis amplio de los niveles transcriptómico, proteómico y metabolómico. Se reserva una parte de las muestras por si fuera necesario utilizarlas en ulteriores análisis.

- Técnicas «convencionales». Incluye hemograma completo y determinaciones séricas de analítica convencional y de marcadores genéricos de inflamación [proteína C reactiva (CRP) ultrasensible, fibrinógeno y glico-marcadores], estrés oxidativo [8-isoprostano, malondialdehído, glutatión reducido, proteína secretora de las células «club» (CC) -16 y granzima (Gzm) B], infección (procalcitonina) y disfunción cardiovascular [péptido natriurético tipo B (BNP) y pro-BNP].

- Análisis transcriptómico. Se utilizan muestras tratadas de forma específica para preservar el ácido ribonucleico (ARN). Estas muestras se procesan para secuenciación masiva (NextSeq, Illumina, San Diego, EE.UU.), según procedimiento ya descrito en la literatura30, lo que permite el análisis de más de 25.000 genes por muestra. Dicho análisis se realiza en la plataforma de transcriptómica de la Universidad Pompeu Fabra de Barcelona (UPF). Los resultados son analizados por bioinformáticos y clínicos de nuestro grupo mediante programas específicos convencionales, con análisis funcional posterior a través de Gene Ontology (GO, Gene Ontology Consortium)31 y Human Phenotype Ontology (HPO, Charité, Berlín, Alemania)32. Los resultados de transcriptomas seleccionados entre los que demuestren un valor discriminatorio elevado se confirmarán por la técnica cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (qRT-PCR).

- Análisis proteómico. Incluye tanto técnicas masivas (para proteínas de mediana/alta concentración sanguínea) como semimasivas (para proteínas con concentración más baja). Para las primeras se empleará la espectrometría de masas tríbrida de alta velocidad (Orbitrap Fusion Lumos, Filgen Inc., Nagoya, Japón), a realizar en el Centro de Regulación Genómica (CRG) de Barcelona según metodología estándar33, mientras que las segundas se basan en arrays (Affimetrix) dirigidos a facetas biológicas concretas, seleccionadas por los procedimientos ya mencionados. En concreto, y siguiendo una técnica convencional34, se estudiarán 45 biomarcadores-diana, incluyendo hormonas y moléculas relacionadas [hormonas adrenocorticotropa (ACTH), del crecimiento (GH), y estimulante del tiroides (TSH), péptido C, ghrelina, glucagón, insulina y leptina], marcadores de inflamación [quimioquina expresada y secretada por células T, regulada por activación (RANTES), interferón (IFN) -α2, IFN-γ, interleucina (IL) -1α, IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, IP-10, proteína quimiotáctica del monocito (MCP) -1, proteína inflamatoria del macrófago (MIP) -1α, MIP-1β, factor de necrosis tumoral (TNF) -α, TNF-β, factor de crecimiento transformante (TGF) -β y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)], marcadores de lesión o remodelado tisular (troponina C, desmosina, elastina y proteína D del surfactante), de infección [procalcitonina y proteína ligada al polisacárido (LBP)] y de disfunción endotelial [molécula soluble de adhesión intercelular (sICAM) -1]. Con posterioridad se determinarán mediante análisis por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) los marcadores seleccionados por mostrar señal altamente discriminatoria con las técnicas de rastreo anteriores.

- Análisis metabolómico. Se efectuará mediante espectrometría de masas con analizadores tipo quadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF-MS) (QSTAR XL Hybrid System, Applied Biosystems. Foster City, CA, EE.UU.), y fuentes de ionización tipo electrospray (ESI) o fotospray (APPI). La muestra se introducirá por infusión directa (DIMS) mediante bomba de baja presión y jeringa tipo Hamilton de 1000μL, a un flujo de 5μL/min. El estudio se completará con el realizado mediante cromatografía de gases (GC-MS), orientado a los metabolitos más volátiles. En los casos en que se estime necesario se obtendrán perfiles metabólicos adicionales mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida de ultra alta resolución, también con analizadores tipo quadrupolo-tiempo de vuelo (UHPLC-Q-TOF-MS). En todos los casos se utilizará metodología ya validada en la literatura35. Para el análisis de resultados se emplearán las bases de datos metabólicas METLIN Metabolomics Database (Scripps Research Institute, San Diego, CA, EE.UU.), FIEHN (NIH West Coast Metabolomics Center, Davis, CA, EE.UU.), HMDB (Human Metabolome Database, TMIC, Edmonton, AL, Canadá) y AMIX (Bruker, Billerica, MAS, EE.UU.), entre otras.

Los datos clínicos, funcionales y biológicos convencionales se han recogido en una base de datos única. En cuanto al análisis de los niveles transcriptómico, proteómico y metabolómico, con evaluación posterior de sus interacciones recíprocas, se emplearán las plataformas y paquetes estadísticos antes citados, así como los programas SPSS 18.0 (IBM Corp.) y R (GPL, programa de uso libre), mediante paquetes de software de BIOCONDUCTOR (PMID:25633503). Se establecerán comparaciones atendiendo a diferentes criterios dicotómicos, que incluyen presencia de enfermedad, gravedad de esta según la alteración funcional (leves-moderados frente a graves-muy graves), presencia o no de «fragilidad» (definición ya mencionada), presencia o no de eosinofilia, presencia o no de alteraciones nutricionales, presencia o no de enfisema marcado, presencia o no de bronquiectasias, sexo del paciente, etc. Para el control de calidad y evaluación de los posibles efectos de homogeneidad por grupo de muestras (batch) se utilizará el módulo de componentes principales de Partek. Las relaciones entre variables se calcularán mediante coeficientes convencional y biserial de Pearson. También se realizará un análisis multivariado de regresión logística, que permitirá ajustar el efecto de las distintas covariables. Para ello se diseñará un modelo normal multivariable (MVN) mediante el paquete R «nlme» (función «gls»), lo que permitirá valorar asociaciones entre los diferentes niveles clínicos y biológicos. Estos modelos consideran todos los perfiles ómicos simultáneamente como un resultado multivariado Y. La matriz de varianza-covarianza se modela por tanto de manera flexible, por lo que la covarianza depende de las variables clínicas principales y permite diferentes coeficientes para cada condición clínica escogida. Así, la variable biológica escogida (Y) para cada individuo y escenario clínico (p.ej., su fenotipo) sigue una distribución normal multivariada con un vector promedio (μ) y una matriz de covarianza (Σ) Y ∼ MVN(μ, Σ). La matriz de varianza-covarianza no estructurada se modela utilizando la identificación de los sujetos como factor de agrupamiento. La integración de datos de las diversas «ómicas» se llevará a cabo mediante el análisis de correlaciones canónicas múltiples (PMID:19377034). Finalmente se realizará con los resultados un análisis de clusters para definir eventuales nuevos endotipos de la enfermedad, según metodología ya utilizada previamente por diversos autores del grupo10. Para el análisis se cuenta con la estructura humana y tecnológica del Programa de Investigación en Informática Biomédica [GRIB, perteneciente al Instituto Hospital del Mar de Investigación Médica (IMIM) y a la UPF].