Una vez anestesiados, los animales deben ser intubados con catéteres de 14G (ratas >300g), 16 G (rata de 200-300g) o 22 G (ratones de unos 25g) y ventilados mecánicamente. En el caso del receptor, suele recomendarse el modo de ciclado por presión, dado que su pulmón izquierdo no será funcional durante gran parte de la cirugía.

Para la programación del ventilador, se recomienda establecer un volumen corriente de 7-10ml/kg (si está ciclado por volumen), una presión máxima de 10-12cmH2O (si está ciclado por presión) y una frecuencia respiratoria de 60-100 respiraciones/min. Además, es muy recomendable aplicar una presión positiva al final de la espiración de 2-5cmH2O para evitar la formación de atelectasias durante la espiración.

Existen equipamientos específicos para roedores que permiten el registro de pulsioximetría, capnografía, presiones arteriales no invasivas o electrocardiograma. En general, los equipos diseñados para humanos o para animales de mayor tamaño no son adecuados para roedores.

Además, es relevante monitorizar la temperatura corporal mediante un termómetro o sonda rectal para mantenerla entre 37,5-38,5°C. La hipotermia es una complicación muy frecuente en roedores y produce muchos efectos adversos si se alcanzan temperaturas inferiores a 32°C, incluyendo un retraso en la recuperación de la anestesia. Para mantener la temperatura corporal, se emplea una manta eléctrica o de agua caliente, aunque vigilando la posible hipertermia que pueda provocar. La saturación de oxihemoglobina suele mantenerse en niveles superiores al 99% cuando la fracción inspirada de oxígeno se incrementa entre un 30 o 60% con respecto al 21% del aire ambiental.

Suele recomendarse la extracción de todo el bloque cardiopulmonar. Bajo anestesia y con el animal en decúbito supino, se prepara el campo operatorio rasurando la piel del tórax y aplicando povidona iodada o clorhexidina de forma centrípeta desde el centro del tórax. Posteriormente, se realiza una esternotomía media con heparinización (100UI/100g) en vena cava inferior, subcutánea o intracardíaca, para evitar la formación de coágulos en el pulmón a trasplantar. Con un microscopio óptico, se procede a la disección del hilio pulmonar para localizar el cayado aórtico y pinzarlo. Simultáneamente, se realizan cortes a nivel de las aurículas y vena cava inferior.

En la mayoría de los modelos se lleva a cabo una perfusión anterógrada, a través del ventrículo derecho19,20 o del tronco pulmonar15,21–23, aunque es conveniente combinarla con la perfusión retrógrada desde la aurícula izquierda22 para simular las condiciones fisiológicas. Los pulmones deben ser perfundidos a una presión mantenida (10-15cmH2O), de forma homogénea, con una solución de preservación fría (4°C) de glucosa dextrano bajo en potasio (LDPG).

A continuación, se liga y secciona la tráquea para extraer todo el bloque cardiopulmonar con el pulmón insuflado, para evitar la formación de atelectasias y mejorar la oxigenación y la presencia de surfactante, lo que reduce el daño isquemia-reperfusión24,25. Las recomendaciones de inflado varían entre un 50% de la capacidad pulmonar total22,25 y un 75-100%26 sin llegar a provocar barotrauma. Además, el insuflado previo a la preservación reduce la expresión de marcadores proinflamatorios tras la reperfusión26.

Con respecto a la preservación del órgano trasplantado, el pulmón donante se suele mantener a 4°C para minimizar el daño isquémico del injerto pulmonar27. La solución de preservación más utilizada es el dextrano bajo en potasio (Perfadex)16,28-30, aunque también se emplean otras soluciones, como Celsior31, Euro-Collins o Wisconsin24.

Una vez extraído el bloque pulmonar, se debe individualizar el pulmón izquierdo pinzando el bronquio para mantenerlo insuflado. Junto con la arteria y vena pulmonares, se secciona el bronquio lo más distal posible al pulmón para facilitar las anastomosis (fig. 1).

Figura 1.

Extracción y preparación del pulmón donante. Realización de una estereotomía media y disección y extracción del bloque cardiopulmonar. Disección de la arteria pulmonar izquierda (LPA), vena pulmonares izquierdas (LPV) y del bronquio izquierdo (LBr).AO: aorta torácica; IVC: vena cava inferior; LA: aurícula derecha; L SVC: vena cava superior izquierda; LL: pulmón izquierdo; RA: aurícula izquierda; RL: pulmón derecho; R SVC: vena cava superior derecha.

(0.13MB).

La preparación del pulmón izquierdo variará en función de la forma de realizar las anastomosis: anastomosis vascular y bronquial con puntos de sutura6,19,21,32, anastomosis bronquial con puntos de sutura y empleo de manguitos vasculares o cuffs30,33-36, y anastomosis vascular y bronquial mediante manguitos20,22,23,35-39 (fig. 2). En el primer caso, se procede a la disección del hilio pulmonar individualizando cada estructura a anastomosar y manteniendo el pulmón en el medio de conservación a baja temperatura. En los 2 últimos casos, las uniones vasculares y bronquiales se simplifican al no emplear suturas sino unos manguitos, usados tanto en el trasplante pulmonar33 como de otros órganos40-42. Se trata de estructuras anulares constituidas por policloruro de vinilo o teflón, fabricadas a partir de cánulas o catéteres, cuyo tamaño en la rata oscila de 18 a 14G, siendo los de mayor diámetro los empleados en el bronquio, y los más pequeños, en la arteria pulmonar22. Los manguitos tradicionales están constituidos por un cuerpo, que es donde se fijan los vasos o el bronquio, y una lengüeta para permitir una fácil manipulación de los mismos (fig. 3). Su longitud es de 2-3mm (cuerpo de 1, 1,5 o 2mm y lengüeta de 1 o 1,5mm). Existe un modelo modificado de manguitos en el que se ha eliminado la lengüeta32,36,43, pero ello complica su manipulación. Por este motivo, algunos grupos utilizan el manguito convencional y, tras realizar la anastomosis, eliminan la lengüeta33.

Figura 2.

Técnicas quirúrgicas descritas de trasplante pulmonar en modelos murinos. A) Anastomosis vascular y bronquial con puntos de sutura. B) Anastomosis bronquial con puntos de sutura y empleo de manguitos vasculares o cuffs en vena y arteria pulmonares. C) Anastomosis vascular y bronquial mediante manguitos o cuffs.LBr d: bronquio izquierdo de animal donante; LBr r: bronquio izquierdo de animal receptor; LPA d: arteria pulmonar izquierda de animal donante; LPA r: arteria pulmonar izquierda de animal receptor; LPV d: vena pulmonar izquierda de animal donante; LPV r: vena pulmonar izquierda de animal receptor.

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Figura 3.

Esquema de colocación de un manguito o cuff en el pulmón donante y su anastomosis en el pulmón receptor.LBr d: bronquio izquierdo de animal donante; LBr r: bronquio izquierdo de animal receptor; LPA d: arteria pulmonar izquierda de animal donante; LPA r: arteria pulmonar izquierda de animal receptor; LPV d: vena pulmonar izquierda de animal donante; LPV r: vena pulmonar izquierda de animal receptor.

(0.15MB).

Independientemente del tipo de manguito utilizado, la colocación se realiza introduciendo la vena, arteria o bronquio del pulmón donante a través del orificio del cuerpo del manguito, para posteriormente evertirlos fijando los tejidos con sutura de polipropileno de 7/0 o 8/0 en la rata22,23 y de 10/0 en el ratón18. En ocasiones, el bronquio es preparado justo antes del momento del implante para evitar la entrada de líquido de preservación18,20.

Bajo anestesia y una adecuada analgesia, se coloca al animal en decúbito lateral derecho. Se prepara el campo quirúrgico como en el animal donante y se realiza una toracotomía lateral a través del cuarto espacio intercostal. Se extrae el pulmón izquierdo y se aíslan las principales estructuras pinzando la arteria, vena y bronquio pulmonares izquierdos, siempre lo más distal posible al pulmón. La sección de dichas estructuras se realiza lo más próximo posible al parénquima pulmonar. Para evitar la formación de coágulos, se aplica suero heparinizado (0,5-1UI/ml) a la arteria y vena. La manipulación de todas las estructuras debe ser cuidadosa para evitar desgarros vasculares.

A continuación, se procede a realizar las anastomosis de las estructuras vasculares y del bronquio. En la figura 4 aparecen reflejadas, en una imagen real, las anastomosis realizadas con manguitos.

Figura 4.

Imagen real del trasplante pulmonar realizado mediante la técnica de cuff a nivel vascular y bronquial.DL: pulmón donante; LBr r: bronquio izquierdo de animal receptor; LPA r: arteria pulmonar izquierda de animal receptor; LPV r: vena pulmonar izquierda de animal receptor.

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Una vez anastomosado el bronquio, se debe ventilar el pulmón donante para evitar la formación de atelectasias y favorecer el reclutamiento alveolar. Una rápida reperfusión del pulmón indica que la permeabilidad vascular de las anastomosis es adecuada. Por último, se extrae el pulmón nativo del animal receptor, dejando únicamente el pulmón donante.

La colocación de un drenaje es fundamental para eliminar los restos de sangre, líquido o aire alrededor de los pulmones y que estos se puedan expandir con normalidad. El cierre de la cavidad torácica se realiza por planos, retirando el drenaje cuando el animal se recupera de la anestesia y comienza su ventilación espontánea.

En función del grupo de trabajo y de la técnica empleada, el tiempo necesario para completar la cirugía varía. Por lo general, se observan tiempos más bajos cuando se emplea la técnica de cuff que cuando se emplean suturas convencionales, especialmente, cuando esto último se realiza en vasos y bronquio. De igual manera, el índice de supervivencia es mejor cuando en las anastomosis se utilizan manguitos frente a puntos de sutura (tabla 2).

Aparece en las primeras 72h y se gradúa en función de la relación PaO2/FiO2 y la presencia de infiltrados radiológicos, siendo una causa muy importante de morbimortalidad durante el postoperatorio inmediato.

Su análisis en modelos murinos ha permitido una mejor caracterización de los mecanismos desencadenantes, en los que la lesión primaria de los neutrófilos originada por la isquemia-reperfusión parece desempeñar un papel nuclear. Así, se ha demostrado que neutrófilos aislados de las vías aéreas de receptores de trasplante estimulan las células dendríticas del donante, por un mecanismo dependiente de contacto, para inducir la producción de IL-12 y expandir linfocitos T específicos del aloantígeno50. A su vez, se ha demostrado que este fenómeno es regulado por la degranulación inducida por el TNF-α asociado a la membrana plasmática de los neutrófilos50. También ha sido posible identificar algunos factores moduladores de esta respuesta celular, que podrían resultar de potencial interés en la identificación de futuras vías terapéuticas. Se ha mostrado que el factor transcripcional Bcl3 limita la granulopoyesis por una vía NF-kB dependiente51.

Los modelos murinos proporcionan un medio ideal para el estudio del rechazo celular agudo, al poder evaluar en cepas puras el grado de concordancia o discordancia del antígeno mayor de histocompatibilidad. Esto resulta particularmente favorecido por el desarrollo de sistemas de monitorización específicos para este modelo de trasplante. Además de los lavados broncoalveolares para el estudio de la celularidad de las vías aéreas y de medir la capacidad de oxigenación a través de los gases en sangre arterial, se han generado técnicas de imagen propias, como la tomografía volumétrica53 o la resonancia magnética ultracorta54, que junto con la evaluación histológica de los cambios ultraestructurales del rechazo agudo mediante microscopia de barrido55 facilitan una mejor monitorización del pulmón trasplantado.

También se han desarrollado procedimientos complementarios para la evaluación de la función pulmonar. Así, la oscilación forzada resulta muy útil en los modelos murinos, ya que tanto la elastancia dinámica como la dependencia de frecuencia de las resistencias parecen tener capacidad predictiva del grado de rechazo agudo56, constituyéndose como índices no invasivos para la detección y monitorización de su progresión. En un ámbito de imagen-función, la microtomografía de emisión de positrones permite identificar un mayor consumo de 18fluorodesoxiglucosa por neutrófilos y linfocitos CD857, pudiendo identificar más precisamente el rechazo agudo a través de la valoración del metabolismo de las células T.

La evaluación de los mecanismos patogénicos del rechazo agudo en modelos murinos ha facilitado el desarrollo de intervenciones para prolongar la supervivencia del injerto, por ejemplo, mediante el bloqueo de los coestimuladores anti-CD28-B7 y del ligando CD40-CD4058. Otros autores han demostrado en un modelo de trasplante pulmonar ortotópico murino MHC-discordante que la monoterapia con anticuerpos anti-CD154 podría ser suficiente para atenuar el rechazo agudo59, debido a un bloqueo de la coestimulación CD154/CD40, que favorece un desplazamiento del entorno del injerto hacia un predominio de células T reguladoras CD4(+) CD25(+) Foxp3(+)60. También se ha referido que algunas células pulmonares no hematopoyéticas pueden desempeñar un importante papel en la supresión in vivo de las respuestas inmunes mediadas por células T CD4(+)61.

Aunque todavía muy incipiente, estos hallazgos podrían tener una potencial traslación clínica mediante el tratamiento con N-acetilcisteína. En modelos murinos, se ha demostrado que su administración tiene capacidad para atenuar el rechazo pulmonar agudo por reducción del infiltrado de macrófagos y células T, que está íntimamente relacionada con la disminución de la vía de señalización inflamatoria mediada por NF-kB62.

Suele manifestarse mediante el desarrollo de bronquiolitis obliterante, debida a una infiltración celular de linfocitos y neutrófilos atribuida a un conjunto de factores, como una activación excesiva de la respuesta del sistema inmune innato, una angiogénesis anormal o una inadecuada regeneración epitelial y remodelado del tejido linfoproliferativo48.

Aunque cada modelo animal tiene ventajas y limitaciones para el estudio de la bronquiolitis obliterante, el modelo de bronquiolitis obliterante secundario al trasplante pulmonar murino resulta más próximo al rechazo crónico humano que otros modelos de bronquiolitis obliterante inducida por agentes químicos. Además, permite valorar de forma seriada tanto la función pulmonar como múltiples alteraciones morfológicas o en la función celular, y probar la eficacia de diversos fármacos. Otra ventaja sustancial viene dada por la disponibilidad de cepas knock-out y transgénicas de modelos de múltiples enfermedades humanas, lo que permite reproducir situaciones de rechazo crónico relativamente similares a las desarrolladas en distintas enfermedades respiratorias terminales, así como evaluar la contribución de potenciales vías de señalización.

Sin embargo, algunos factores de la anatomía y fisiología del pulmón murino ocasionan dificultades de traslación. En relación con los pulmones humanos, los bronquiolos murinos tienen una disminución de las glándulas submucosas y un mayor número de células Clara, lo que genera un entorno protector frente a la lesión del epitelio bronquiolar, principalmente mediante la secreción de proteína secretada por las células Clara y una solución similar al surfactante pulmonar, lo que determina una mayor lesión vascular que epitelial en estos modelos de rechazo58. No obstante, en los últimos años se han realizado importantes avances en el desarrollo de diversos modelos de bronquiolitis obliterante en el ratón63-65, así como estudios con microarrays de ADN para evaluar el rechazo crónico tras el trasplante66.

En conclusión, se han producido importantes desarrollos técnicos en el trasplante pulmonar murino, permitiendo la elección de diversas alternativas quirúrgicas con una notable viabilidad de los animales trasplantados. Esto determina una mayor accesibilidad a estos modelos experimentales quirúrgicos, que han demostrado su capacidad para generar conocimiento sobre los mecanismos patogénicos de la lesión por isquemia-reperfusión y del rechazo, con una potencial traslación al ser humano a medio plazo.