El factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante induce la progresión de la supervivencia celular mediada por Akt en ratones enfisematosos

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Se observa también el agrandamiento del tronco de la arteria pulmonar (doble punta de flecha). b) TC de tórax con ventana temporal que muestra el colapso del LMD (estrella), así como un engrosamiento del tejido blando peribronquial del LID (flecha) con obliteración del bronquio del segmento apical del lóbulo inferior derecho." ] ] ] "autores" => array:1 [ 0 => array:2 [ "autoresLista" => "Shahram Kahkouee, Ramin Pourghorban, Mahdi Bitarafan, Katayoun Najafizadeh, Seyed Shahabeddin Mohammad Makki" "autores" => array:5 [ 0 => array:2 [ "nombre" => "Shahram" "apellidos" => "Kahkouee" ] 1 => array:2 [ "nombre" => "Ramin" "apellidos" => "Pourghorban" ] 2 => array:2 [ "nombre" => "Mahdi" "apellidos" => "Bitarafan" ] 3 => array:2 [ "nombre" => "Katayoun" "apellidos" => "Najafizadeh" ] 4 => array:2 [ "nombre" => "Seyed Shahabeddin Mohammad" "apellidos" => "Makki" ] ] ] ] ] "idiomaDefecto" => "es" "Traduccion" => array:1 [ "en" => array:9 [ "pii" => "S1579212915000555" "doi" => "10.1016/j.arbr.2015.02.022" "estado" => "S300" "subdocumento" => "" "abierto" => array:3 [ "ES" => false "ES2" => false "LATM" => false ] "gratuito" => false "lecturas" => array:1 [ "total" => 0 ] "idiomaDefecto" => "en" "EPUB" => "https://multimedia.elsevier.es/PublicationsMultimediaV1/item/epub/S1579212915000555?idApp=UINPBA00003Z" ] ] "EPUB" => "https://multimedia.elsevier.es/PublicationsMultimediaV1/item/epub/S0300289614002191?idApp=UINPBA00003Z" "url" => "/03002896/0000005100000007/v2_201506280052/S0300289614002191/v2_201506280052/es/main.assets" ] "es" => array:20 [ "idiomaDefecto" => true "cabecera" => "Original" "titulo" => "El factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante induce la progresión de la supervivencia celular mediada por Akt en ratones enfisematosos" "tieneTextoCompleto" => true "paginas" => array:1 [ 0 => array:2 [ "paginaInicial" => "328" "paginaFinal" => "337" ] ] "autores" => array:1 [ 0 => array:4 [ "autoresLista" => "Jai Prakash Muyal, Dhananjay Kumar, Sudhir Kotnala, Vandana Muyal, Amit Kumar Tyagi" "autores" => array:5 [ 0 => array:4 [ "nombre" => "Jai" "apellidos" => "Prakash Muyal" "email" => array:2 [ 0 => "jmuyal@gbu.ac.in" 1 => "suds.biotech@gmail.com" ] "referencia" => array:2 [ 0 => array:2 [ "etiqueta" => "a" "identificador" => "aff0005" ] 1 => array:2 [ "etiqueta" => "*" "identificador" => "cor0005" ] ] ] 1 => array:3 [ "nombre" => "Dhananjay" "apellidos" => "Kumar" "referencia" => array:1 [ 0 => array:2 [ "etiqueta" => "a" "identificador" => "aff0005" ] ] ] 2 => array:3 [ "nombre" => "Sudhir" "apellidos" => "Kotnala" "referencia" => array:1 [ 0 => array:2 [ "etiqueta" => "a" "identificador" => "aff0005" ] ] ] 3 => array:3 [ "nombre" => "Vandana" "apellidos" => "Muyal" "referencia" => array:2 [ 0 => array:2 [ "etiqueta" => "b" "identificador" => "aff0010" ] 1 => array:2 [ "etiqueta" => "c" "identificador" => "aff0015" ] ] ] 4 => array:3 [ "nombre" => "Amit" "apellidos" => "Kumar Tyagi" "referencia" => array:1 [ 0 => array:2 [ "etiqueta" => "d" "identificador" => "aff0020" ] ] ] ] "afiliaciones" => array:4 [ 0 => array:3 [ "entidad" => "Department of Biotechnology, School of Biotechnology, Gautam Buddha University, Greater Noida, Uttar Pradesh, India" "etiqueta" => "a" "identificador" => "aff0005" ] 1 => array:3 [ "entidad" => "Department of Internal Medicine, Division of Respiratory Medicine, Philipps-Universität Marburg, Marburg, Alemania" "etiqueta" => "b" "identificador" => "aff0010" ] 2 => array:3 [ "entidad" => "14/Type V, Gautam Buddha University, Greater Noida, Uttar Pradesh, India" "etiqueta" => "c" "identificador" => "aff0015" ] 3 => array:3 [ "entidad" => "Division of Nuclear Medicine, Institute of Nuclear Medicine and Allied Sciences, Defense Research Development Organization, Nueva Delhi, India" "etiqueta" => "d" "identificador" => "aff0020" ] ] "correspondencia" => array:1 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "cor0005" "etiqueta" => "⁎" "correspondencia" => "Autor para correspondencia." ] ] ] ] "titulosAlternativos" => array:1 [ "en" => array:1 [ "titulo" => "Recombinant Human Keratinocyte Growth Factor Induces Akt Mediated Cell Survival Progression in Emphysematous Mice" ] ] "resumenGrafico" => array:2 [ "original" => 0 "multimedia" => array:7 [ "identificador" => "fig0025" "etiqueta" => "Figura 5" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr5.jpeg" "Alto" => 1187 "Ancho" => 1616 "Tamanyo" => 49983 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Expresión relativa del mRNA del antagonista (Pten) de la vía de Akt en el tejido pulmonar completo. El nivel de expresión de Pten mostró una inducción significativa en los pulmones expuestos a elastasa, a diferencia del grupo de tratamiento. En el grupo de tratamiento hubo una disminución significativa de los niveles de expresión de Pten, con unos resultados comparables a los del grupo de control. Los niveles de mRNA de los genes diana se determinaron con los valores relativos respecto al gen de referencia endógeno de la actina β según la fórmula de 2 elevado a la potencia de delta del umbral de ciclo (2ΔCt), en donde ΔCt=Ct, gen de referencia–Ct, gen diana. Los gráficos indican los valores de media con desviación estándar. Los datos se analizaron mediante la prueba de t para datos no emparejados, con objeto de evaluar el efecto del rHuKGF y la elastasa, respectivamente. EK: elastasa- rHuKGF (grupo de tratamiento); ES: elastasa-solución salina (grupo de enfisema); rHuKGF: factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante; SS: solución salina (grupo sano); VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular. *p<0,05 y **p ≤ 0,01 frente al respectivo grupo de control." ] ] ] "textoCompleto" => "IntroducciónLa enfermedad pulmonar obstructiva crónica es un causa importante de la carga de asistencia sanitaria en todo el mundo y la única de las principales causas de muerte cuya prevalencia está aumentando<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0005">1</a>. En EE. UU. comporta una morbilidad del 4% y se sitúa en el cuarto lugar de las causas de muerte<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0005">1</a>. El enfisema pulmonar, que se produce con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, es un diagnóstico anatomopatológico, definido por un agrandamiento destructivo permanente de los espacios aéreos distales a los bronquiolos terminales, que contribuye a limitar el flujo aéreo y se cree que es irreversible<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0010">2</a>. Hasta el momento no disponemos de ningún tratamiento eficaz para restablecer un parénquima pulmonar con un intercambio de gases normal después de que se hayan establecido las alteraciones enfisematosas. Aunque se ha descrito un papel prometedor del tratamiento con ácido all-trans-retinoico en modelos del enfisema en roedores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0015">3</a>, no hay ningún tratamiento de eficacia clínica probada que fomente la recuperación del enfisema establecido<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0020">4,5</a>. Así pues, la inducción de una regeneración alveolar continúa siendo un importante reto para el desarrollo de nuevos tratamientos para el enfisema<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0030">6</a>.El factor de crecimiento queratinocítico (KGF) es un mitógeno potente en diferentes tipos de células epiteliales y facilita la reparación de la piel, la córnea y el recubrimiento gastrointestinal mediante la estimulación de la división y crecimiento de las células<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0035">7–9</a>. Esta reparación epitelial ha motivado un interés por su posible uso para el tratamiento de la lesión epitelial en la lesión pulmonar aguda<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050">10</a>. El KGF modula varios mecanismos que se ha observado que son importantes en la reparación del epitelio alveolar y, por tanto, ha generado un interés como posible intervención terapéutica en la lesión pulmonar aguda. El primer estudio sobre el efecto protector del KGF exógeno en un modelo en roedores con lesión pulmonar aguda fue el presentado por Panos et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0055">11</a>. Los autores indicaron que la administración intratraqueal de KGF humano recombinante (rHuKGF) estimulaba la proliferación de las células de tipo 2 del epitelio alveolar in vivo y reducía la lesión pulmonar inducida por la hiperoxia en las ratas. Posteriormente, el KGF exógeno se ha explorado ampliamente con fines de protección del pulmón frente a la lesión pulmonar experimental, como la inducida por bleomicina<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0060">12,13</a>, neumonía por Pseudomonas aeruginosa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070">14</a>, ácido clorhídrico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0075">15,16</a>, ácido oleico<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085">17</a> o radiación y bleomicina<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090">18</a>. Recientemente, los datos de un modelo de perfusión pulmonar humano ex vivo de la lesión pulmonar inducida por endotoxina han indicado que el tratamiento con KGF mejora la función de barrera epitelial y endotelial pulmonar, y mejora la tasa de eliminación del líquido alveolar, con lo que reduce el edema alveolar<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0095">19</a>. Tiene interés señalar que los suplementos de rHuKGF aplicados a pulmones enfisematosos muestran una regeneración pulmonar del epitelio alveolar y el endotelio capilar, así como una transformación y mantenimiento del tejido intersticial<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100">20</a>. Además, el KGF tiene tendencia a estimular la producción de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en los queratinocitos humanos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0105">21–23</a>. El VEGF es un mitógeno específico de las células endoteliales y participa en la reparación de las heridas, la angiogénesis, la permeabilidad microvascular y la protección vascular. Sin embargo, su expresión en la producción de células está estrictamente regulada por factores de crecimiento<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0110">22</a>. En condiciones normales, estos factores de crecimiento no estimulan de manera directa la angiogénesis, pero pueden modularla a través de la modulación de la expresión de VEGF en tipos celulares específicos, ejerciendo por tanto un efecto angiogénico o antiangiogénico indirecto<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120">24</a>. Entre estos factores de crecimiento, el factor de crecimiento fibroblástico 4<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125">25</a>, el KGF<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130">26</a>, el PDGF<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0135">27</a> y el factor de crecimiento transformador β<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0140">28</a> son los que pueden potenciar la producción de VEGF, que a su vez activa la vía de fosfatidilinosítido-3’-OH cinasa (PI3K)-Akt<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145">29</a>. En especial en el pulmón, la vía de PI3K-Akt regula múltiples procesos celulares, incluida la proliferación, supervivencia, crecimiento y motilidad de las células alveolares<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0150">30,31</a>. Así pues, en el presente estudio, investigamos el posible papel del suplemento exógeno de KGF en la inducción de la supervivencia celular mediada por Akt, mediante la activación de PI3K y sus dianas distales en el enfisema (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>).<elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia>Material y métodosPreparación de los modelos animalesTodos los experimentos realizados en animales se llevaron a cabo atendiendo a lo establecido en las guías institucionales que compilaban las regulaciones nacionales e internacionales, y han sido aprobados por el gobierno regional (IAEC, Ministerio de Medio Ambiente y Silvicultura, India). Todos los modelos animales experimentales se prepararon según lo descrito por Yildirim et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100">20</a>. Se utilizaron ratones machos C57BL de 8 semanas y libres de patógenos, con un peso corporal de unos 20g, que fueron asignados aleatoriamente a 3 modelos experimentales diferentes. Se mantuvo a los ratones bajo anestesia de isoflurano y se les administró o bien elastasa o bien rHuKGF/solución salina mediante instilación orofaríngea. Los detalles del desarrollo de los modelos experimentales se describen en el texto que sigue y en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005">–Modelo de control (solución salina+solución salina [SS]; n=8): La instilación orofaríngea se utilizó para administrar 40μl de solución salina los días 1, 10, 31, 34 y 37.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010">–Modelo de enfisema (elastasa+solución salina [ES]; n=8): Se indujo un enfisema mediante la instilación orofaríngea de elastasa pancreática porcina (2,25mg/kg de peso corporal) en los pulmones de ratones los días 1 y 10. Sin embargo, los pulmones tratados con elastasa recibieron solución salina el día 31, 34 y 37.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015">–Modelo terapéutico del enfisema (elastasa+rHuKGF [EK]; n=8): A los pulmones tratados con elastasa se les aplicaron 10mg/kg de peso corporal de rHuKGF mediante instilación orofaríngea los días 31, 34 y 37.</li></ul><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia>En el día 40, los animales fueron sacrificados con el método de luxación cervical. Se ventilaron los pulmones artificialmente y se perfundieron con solución salina tamponada con fosfato estéril, para la extracción de la sangre. Se utilizó el pulmón derecho para los análisis de histopatología, mientras que los tejidos del pulmón izquierdo se sumergieron de inmediato en un tanque de nitrógeno líquido y se conservaron a −80°C hasta el momento del análisis para los estudios de biología molecular.Fijación del pulmónLos pulmones derechos se fijaron mediante instilación en la vía aérea de paraformaldehído tamponado con fosfato al 6% a una presión de 20cm de columna de líquido y se conservaron una noche en el refrigerador. La deshidratación, limpieza e infiltración se realizaron con el empleo de protocolos estándares. Los cortes de tejido procesados se colocaron en un bloque de parafina y se dejaron enfriar y solidificar antes de realizar los cortes de tejido. A continuación se eliminó la parafina del tejido 3 veces mediante Xylene y se volvió a hidratar con diferentes concentraciones de etanol. Con el empleo de un microtomo (microtomo rotatorio, Spencers, India), se realizaron cortes de tejido finos, de 5μm. Los cortes de tejido finos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E).MorfometríaDestrucción del parénquima: Se utilizó una técnica de recuento de puntos microscópicos para determinar el grado de destrucción del parénquima, en lo que se denomina un análisis de índice de destrucción (DI)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160">32</a>. Se colocó una lámina transparente con 83 puntos de recuento sobre una impresión en tamaño A4 de las imágenes microscópicas procedentes de los cortes teñidos. Para cada pieza pulmonar se utilizó la media de 3 cortes diferentes, y se seleccionaron en los cortes generalmente 3 campos no solapados representativos. La evaluación de la presencia de destrucción se llevó a cabo mediante el recuento de los puntos de solapamiento de espacios alveolares y ductales, según lo descrito por Robbesom et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165">33</a>. Se calculó el porcentaje del total de puntos incluidos en las diversas categorías de espacios aéreos destruidos, para obtener el DI, utilizando la fórmula [D/(D+N)]x100%, en donde D=destruidos y N=normales. Se calcularon las diferencias de DI en los grupos de enfisema y de tratamiento respecto al grupo de control (100%).Aislamiento del ARN total del pulmón izquierdo y síntesis de cDNAPara investigar la expresión relativa del mRNA en el tejido pulmonar, se extrajo el ARN total con el empleo de una técnica basada en el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Nueva Delhi, India) con una pequeña modificación del protocolo de Muyal et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">34</a>. Se determinó la cantidad y la pureza del ARN total con Nanodrop (Thermo Scientific, EE. UU.) mientras que la calidad de la integridad del ARN total se evaluó analizando el ARN ribosómico 18S y 28S en una electroforesis en gel de agarosa teñida con bromuro de etidio al 1,2%. Se sintetizó el cDNA de primera hebra mediante la introducción de cantidades iguales de ARN (300ng) de cada muestra en un volumen de reacción total de 20μl con el empleo de un cebador Oligo dt (Qiagen, Nueva Delhi, India) y un Omniscript RT Kit (Qiagen, Nueva Delhi, India) y los respectivos protocolos. La reacción se incubó a 37°C durante 1h en Thermoblock TB2 (Biometra, Goettingen, Alemania).Cuantificación de mRNA relativaSe realizó una PCR en tiempo real para determinar el factor de amplificación de los genes diana (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>) en un formato de 96 pocillos de Stratagene Mx 3005P (Agilent Technologies, Inc., EE. UU.) en un volumen de reacción total de 20μl, utilizando 10μl de un QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Nueva Delhi, India), 1μl de cada cebador oligonucleótido directo e inverso con especificidad de secuencia (10pmol), 7μl de agua y 1μl de cDNA. Las condiciones de los ciclos térmicos utilizadas en todas las reacciones fueron las siguientes: paso 1: 95°C durante 15min; 30 ciclos de paso 2 (95°C durante 45s); paso 3 (temperatura de templado del cebador oligonucleótido de secuencia específica; véase la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> para los 35s); y paso 4 (72°C durante 45s), seguido de un tiempo de paso 5: 72°C, 5min.<elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia>Aislamiento de proteínas y western blot para factor de crecimiento endotelial vascularSe extrajo la proteína total de 100mg de WLT con el empleo de un kit de extracción de proteína total (Biochem Life Sciences, Nueva Delhi, India). El protocolo para western blot de VEGF se ha llevado a cabo según lo descrito por Yildirim et al. para el western blot de VEGFR2<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100">20</a>.Análisis estadístico de la cuantificación de mRNA relativaSe determinaron los niveles de genes diana de mRNA relativos al control endógeno de actina β, según la fórmula de 2 elevado a la potencia de delta del umbral de ciclo (2ΔCt), en donde ΔCt=Ct, gen de referencia–Ct, gen de estudio. Se evaluó la significación estadística de las diferencias entre los grupos experimentales con el empleo de una prueba de Mann-Whitney no paramétrica (GraphPad Prism versión 4, San Diego, EE. UU.). Los niveles de significación se indican mediante *=p<0,05; **=p<0,01.ResultadosEfectos del factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante sobre la arquitectura tisularLa instilación orofaríngea de 2,25mg de elastasa pancreática porcina /kg de peso corporal en 2 ocasiones (días 0, 10) produjo un enfisema pulmonar grave, tal como se muestra en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">figura 3-I-B</a> de una microfotografía obtenida en el estudio histopatológico. Sin embargo, la microfotografía de los pulmones enfisematosos tratados con rHuKGF mostró de manera evidente la recuperación de los tabiques alveolares perdidos en el grupo de tratamiento (EK, <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3-I-C</a>) y fue comparable al grupo de control (SS, <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3-I-A</a>). En la determinación del DI de los cortes de tejido de los 3 modelos animales (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3-I-D, E y F</a>), el modelo de ratones enfisematosos mostró unos valores de DI significativamente superiores a los del modelo de control (p<0,001). Sin embargo, el DI se redujo significativamente (p<0,001) en el caso de los modelos de tratamiento, es decir, los pulmones enfisematosos de ratones tratados con rHuKGF (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3-II</a>).<elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia>Efectos del factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante sobre el factor de crecimiento endotelial vascular, receptor de factor de crecimiento endotelial vascular, fosfatidilinosítido-3’-OH cinasa y AktEn un estado normal, la unión de VEGF al VEGFR2 activa la cascada de señalización de Akt distal, lo cual interviene, a su vez, en la supervivencia de las células (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>). Para determinar si el suplemento de rHuKGF induce la cascada de señalización de Akt en los pulmones enfisematosos, evaluamos los niveles de expresión de mRNA de VEGF, VEGFR 2, PI3K y Akt respectivamente. En contraste con los pulmones enfisematosos, el grupo de tratamiento (EK) muestra la inducción favorable de los niveles de mRNA de VEGF (p<0,05), VEGFR2 (p<0,03), PI3K (p<0,001) y Akt (p<0,02), respectivamente. Sin embargo, la expresión de estos genes estaba notablemente reducida en los pulmones enfisematosos (ES) en comparación con los sanos (SS) (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4-I</a>). Además, en la validación de la expresión de VEGF a nivel de proteína, el análisis de western blot para el VEGF muestra un patrón similar al observado a nivel de mRNA (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4-II</a>).<elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia>Efectos del factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante sobre el antagonista para la vía de AktSe ha descrito que el Pten es un regulador negativo de la vía de supervivencia celular de Akt. Su sobreexpresión da lugar a una desregulación de la señalización de la supervivencia celular. Nuestros datos muestran una regulación positiva significativa de la expresión del mRNA del Pten (p<0,04) en los pulmones enfisematosos (ES) en comparación con los sanos (SS). El papel beneficioso del rHuKGF en los pulmones enfisematosos se apreció también en una reducción significativa del nivel de mRNA de Pten (p<0,008) en comparación con el grupo de ES, y es importante señalar que fue comparable a lo observado en los pulmones sanos (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>).<elsevierMultimedia ident="fig0025"></elsevierMultimedia>Efectos del factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante sobre los marcadores de apoptosisPara que se produzca una pérdida de unidades alveolares, sería de prever que, incluso en el modelo de enfisema con elastasa pancreática porcina, hubiera también una cierta apoptosis de las células alveolares. Para evaluar la apoptosis en nuestros modelos animales experimentales, se estudió la expresión de mRNA de marcadores de la apoptosis, es decir caspasa-9 y Bad, en la vía Akt. En este caso, los niveles normalizados de mRNA de caspasa-9 (p<0,01) y Bad (p<0,01) en el tejido pulmonar enfisematoso (ES) mostraron una regulación positiva significativa en comparación con los pulmones sanos (SS). Sin embargo, se observó un efecto prometedor del rHuKGF en el estado de enfisema (EK). En el grupo de tratamiento (EK), observamos una reducción de los niveles de expresión de caspasa-9 (p<0,02) y Bad (p<0,0007) en comparación con los pulmones enfisematosos (ES), lo cual indica que el rHuKGF tiene una tendencia a contrarrestar la apoptosis de las células alveolares (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0030">fig. 6</a>).<elsevierMultimedia ident="fig0030"></elsevierMultimedia>DiscusiónLa patogenia del enfisema pulmonar no se conoce por completo, aunque se han propuesto varios mecanismos, como un desequilibrio de proteasas y antiproteasas, inflamación crónica y estrés oxidativo. Además de estos mecanismos, estudios recientes muestran otro mecanismo involucrado en el desarrollo del enfisema pulmonar que se basa en un aumento de las células endoteliales y epiteliales alveolares apoptósicas en los pulmones<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175">35</a>. Sin embargo, la formación del enfisema pulmonar puede interpretarse también como la consecuencia de un fallo de los procesos de reparación del pulmón. En la actualidad, no disponemos de ninguna opción terapéutica que permita la reparación de los alvéolos perdidos en el estado enfisematoso. Así pues, la inducción de una regeneración alveolar continúa siendo un importante reto para el desarrollo de nuevos tratamientos para el enfisema. Tan solo recientemente, la administración de KGF ha mostrado ser el factor de crecimiento potente que posee propiedades tanto protectoras como curativas en el estado de enfisema<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0100">20,36</a>. Sin embargo, los mecanismos moleculares distales que rigen la supervivencia de las células alveolares no se han abordado por el momento. Así pues, en el presente estudio, hemos intentado mostrar el posible efecto del rHuKGF en la activación de la cascada de señalización de Akt, mediante la estimulación de la producción de VEGF en ratones enfisematosos.Nuestros resultados muestran claramente un posible papel del rHuKGF en los pulmones de ratones enfisematosos. El papel prospectivo del rHuKGF se observó claramente en la arquitectura tisular con el empleo de histopatología del análisis del DI basado en morfometría. Las microfotografías mostraron la pérdida de los tabiques alveolares en los pulmones enfisematosos en comparación con los pulmones sanos. Se observó que esta pérdida de los tabiques alveolares se recuperaba en el grupo de tratamiento y era del todo comparable a la de los grupos sanos. Yildirim et al. han descrito una observación similar, con el empleo de la longitud de intersección media como instrumento para cuantificar el daño y la recuperación del tejido alveolar<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100">20</a>. En nuestro estudio utilizamos un análisis basado en el DI como instrumento para cuantificar tanto el daño como la recuperación del tejido alveolar, con objeto de abordar el papel prospectivo del rHuKGF. El valor medio de DI de los pulmones enfisematosos es superior al valor de los pulmones sanos. Robbesom et al. observaron también un valor de DI similar en los grandes fumadores en comparación con los controles<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165">33</a>. Creemos que los valores más altos de DI pueden deberse a las condiciones de medida estrictas de nuestro estudio, lo cual descarta posibles sesgos como un tejido con insuflación subóptima. Tiene interés señalar que los valores de DI se redujeron de manera significativa con el suplemento de rHuKGF en los pulmones enfisematosos. Este efecto recíproco en los valores de DI puede deberse a una regeneración de las paredes de los tabiques alveolares, que dio lugar a un aumento del número de espacios alveolares intactos. Aparte del papel prospectivo del rHuKGF sobre la arquitectura tisular, a continuación, se investigó el papel prospectivo del rHuKGF en la cascada de señalización de Akt en los pulmones de ratones enfisematosos en el presente trabajo.Según lo indicado por Shiojima et al., la unión del VEGF al VEGFR2 activa la cascada de señalización de Akt, lo cual es importante en la supervivencia, proliferación y migración celulares y en la angiogénesis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185">37</a>. Además, el KGF tiene una posible tendencia a inducir la activación del Akt, lo cual puede ser el mecanismo común subyacente en la citoprotección de las células epiteliales de diferentes tejidos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190">38,39</a>. En el pulmón, Ray et al. obtuvieron unos resultados similares, y señalaron que el KGF estimula la secreción de VEGF, lo cual potencia la citoprotección de las células endoteliales mediante la activación de Akt<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200">40,41,29</a>. En este estudio se observó que con el suplemento de rHuKGF en los pulmones enfisematosos, los niveles de mRNA de los genes candidatos (VEGF, VEGFR2, PI3K y Akt), involucrados en la cascada de señalización de Akt, tienen una regulación positiva hasta el nivel óptimo, igual que se observa en los pulmones sanos. Además, la expresión de proteína del VEGF sufrió una inducción significativa en los pulmones enfisematosos tratados con rHuKGF. Esto sugiere que el rHuKGF tiene el potencial de establecer una arquitectura pulmonar normal, tras la pérdida de los tejidos alveolares, mediante la estimulación de la expresión de VEGF en los pulmones enfisematosos. Anteriormente se ha descrito que, en los pulmones enfisematosos de pacientes fumadores y pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la expresión de mRNA y de proteína de VEGF y VEGFR2 presentaron una regulación negativa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215">42</a>. Esta reducción de la expresión de VEGF/VEGFR puede conducir a una apoptosis de las células endoteliales con los consiguientes cambios enfisematosos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0220">43–46</a>.Además, los pulmones enfisematosos a los que se aplica un suplemento de KGF muestran una inducción en los niveles de mRNA de PI-3K, que estaban reducidos en esos pulmones. Esta inducción de PI-3K mejora la interacción de VEGFR2 con PI-3K para la activación de la cascada de señalización distal, con lo que se mantiene la viabilidad celular<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240">47</a>. Además, el efecto favorable del rHuKGF se observó también a nivel del mRNA de Akt. Se observó que la expresión que estaba reducida en el grupo de enfisema aumentaba tras los suplementos de rHuKGF en los pulmones enfisematosos. Esta inducción en la expresión de Akt puede tener múltiples efectos beneficiosos sobre los procesos celulares, en especial en cuanto a la proliferación y supervivencia de las células alveolares. La inducción de la actividad de la Akt cinasa producida por el KGF de un modo dependiente de la dosis y del tiempo ha sido comentada también por Shenying et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245">48</a>. Sus resultados concluyeron que el KGF tiene la máxima eficacia en el mantenimiento de la viabilidad celular mediante la estimulación de la actividad de la Akt cinasa antes de la exposición a los estímulos inductores de apoptosis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245">48</a>.Nosotros observamos también que el rHuKGF tiene el potencial de reducir al mínimo la sobreexpresión de Pten y caspasa-9 a un nivel óptimo en los pulmones enfisematosos. El Pten actúa como un antagonista de la supervivencia celular mediante la regulación negativa de la vía de Akt a través de la desfosforilización<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250">49</a> y por tanto la inhibición del fosfatidilinositol 3, 4, 5-trifosfato (PI [3, 4, 5] P3). Se ha descrito que la sobreexpresión de Pten en el epitelio alveolar causa una notable reducción de la proliferación celular, un aumento notable de la apoptosis y una diferenciación funcional incompleta, lo cual comporta una regulación negativa de la vía de la supervivencia celular<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255">50</a>. De igual modo, se ha observado que el aumento de la expresión de la caspasa-9 interviene en la apoptosis celular y la disminución de la supervivencia celular<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260">51</a>. En este estudio, los niveles de mRNA de Pten y caspasa-9 en los pulmones enfisematosos tratados con suplementos de rHuKGF presentaron una regulación negativa, a diferencia de lo observado en los pulmones enfisematosos. Estos cambios favorables podrían deberse a una supresión de la sobreexpresión de Pten y caspasa-9<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245">48</a> y a una inducción de la activación de Akt que favorece la disminución de la apoptosis de las células alveolares y el aumento de la supervivencia celular.El Bad proapoptósico es la diana principal de Akt y el Akt fosforila el Bad, con lo que lo hace inactivo para la señal de apoptosis<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0265">52,53</a>. Datta et al. plantearon la hipótesis de que la vía de PI3K-Akt puede conducir a una fosforilación del Bad y puede inhibir por tanto la muerte celular y promover la supervivencia de las células<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0275">54,55</a>. En especial en el estado de enfisema Hu et al. mostraron un aumento de la expresión de Bad en las células de músculo liso de vías aéreas humanas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0285">56</a>. En nuestro estudio se observó que la expresión de Bad estaba regulada positivamente en los pulmones enfisematosos en comparación con los sanos, lo cual podría deberse al fallo de la fosforilización del Bad por el Akt. Sin embargo, el posible efecto del rHuKGF sobre el Bad se evaluó con mayor detalle en los pulmones enfisematosos. La expresión del Bas mostró una notable regulación negativa en el grupo de tratamiento en comparación con los pulmones enfisematosos y fue idéntica a la de los pulmones sanos. Estos resultados respaldan nuevamente los posibles efectos favorables del suplemento de rHuKGF en un programa de supervivencia y mantenimiento celulares.Los datos generados por este estudio muestran claramente que el rHuKGF puede ser una medicina molecular potente, que pueda inducir el VEGF endógeno y producir señales de supervivencia importantes que son necesarias para el mantenimiento de la estructura normal del pulmón.ConclusiónLos resultados de este trabajo ponen de manifiesto la eficacia terapéutica del rHuKGF para rectificar la vía de supervivencia celular dependiente de Akt que está desregulada en el estado de enfisema. Los efectos favorables se apreciaron en la arquitectura del tejido y en su análisis cuantitativo. Además, los genes que se asocian a la vía de la supervivencia celular dependiente de Akt que regulan la supervivencia de las células alveolares se expresaron de manera constructiva con los suplementos de rHuKGF exógeno en los pulmones enfisematosos. Considerados conjuntamente, los resultados indican que el mantenimiento de la supervivencia celular en el grupo de tratamiento fue inducido por la mejora de la vía de supervivencia celular dependiente de Akt; y plantean la posibilidad de tratar a los pacientes con enfisema. No obstante, deberán realizarse estudios más detallados.Contribuciones específicas de cada autorJai Prakash Muyal participó en el diseño del estudio y llevó a cabo la preparación del modelo animal, el análisis estadístico y supervisó el trabajo y colaboró en la elaboración de la versión preliminar del manuscrito. Dhananjay Kumar llevó a cabo el aislamiento del ARN de los tejidos pulmonares, la síntesis de cDNA y la PCR cuantitativa. Sudhir Kotnala realizó la histopatología, el análisis del índice de destrucción y el western blot. Vandana Muyal participó en el western blot y en la preparación del manuscrito. Amit K. Tyagi colaboró en la preparación de los diferentes modelos animales.Conflicto de interesesLos autores declaran no tener conflictos de intereses directa ni indirectamente relacionados con el contenido del manuscrito." "textoCompletoSecciones" => array:1 [ "secciones" => array:12 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "xres528052" "titulo" => "Resumen" "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0005" "titulo" => "Introducción" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0010" "titulo" => "Métodos" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0015" "titulo" => "Resultados y discusión" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0020" "titulo" => "Conclusión" ] ] ] 1 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec548326" "titulo" => "Palabras clave" ] 2 => array:3 [ "identificador" => "xres528051" "titulo" => "Abstract" "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0025" "titulo" => "Introduction" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0030" "titulo" => "Methods" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0035" "titulo" => "Results and discussion" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0040" "titulo" => "Conclusion" ] ] ] 3 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec548327" "titulo" => "Keywords" ] 4 => array:2 [ "identificador" => "sec0005" "titulo" => "Introducción" ] 5 => array:3 [ "identificador" => "sec0010" "titulo" => "Material y métodos" "secciones" => array:7 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0040" "titulo" => "Preparación de los modelos animales" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0045" "titulo" => "Fijación del pulmón" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "sec0050" "titulo" => "Morfometría" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "sec0055" "titulo" => "Aislamiento del ARN total del pulmón izquierdo y síntesis de cDNA" ] 4 => array:2 [ "identificador" => "sec0060" "titulo" => "Cuantificación de mRNA relativa" ] 5 => array:2 [ "identificador" => "sec0065" "titulo" => "Aislamiento de proteínas y western blot para factor de crecimiento endotelial vascular" ] 6 => array:2 [ "identificador" => "sec0070" "titulo" => "Análisis estadístico de la cuantificación de mRNA relativa" ] ] ] 6 => array:3 [ "identificador" => "sec0015" "titulo" => "Resultados" "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0075" "titulo" => "Efectos del factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante sobre la arquitectura tisular" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0080" "titulo" => "Efectos del factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante sobre el factor de crecimiento endotelial vascular, receptor de factor de crecimiento endotelial vascular, fosfatidilinosítido-3’-OH cinasa y Akt" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "sec0085" "titulo" => "Efectos del factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante sobre el antagonista para la vía de Akt" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "sec0090" "titulo" => "Efectos del factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante sobre los marcadores de apoptosis" ] ] ] 7 => array:2 [ "identificador" => "sec0020" "titulo" => "Discusión" ] 8 => array:2 [ "identificador" => "sec0025" "titulo" => "Conclusión" ] 9 => array:2 [ "identificador" => "sec0030" "titulo" => "Contribuciones específicas de cada autor" ] 10 => array:2 [ "identificador" => "sec0035" "titulo" => "Conflicto de intereses" ] 11 => array:1 [ "titulo" => "Bibliografía" ] ] ] "pdfFichero" => "main.pdf" "tienePdf" => true "fechaRecibido" => "2014-01-04" "fechaAceptado" => "2014-04-29" "PalabrasClave" => array:2 [ "es" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Palabras clave" "identificador" => "xpalclavsec548326" "palabras" => array:4 [ 0 => "Enfisema" 1 => "Factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante" 2 => "Vía de Akt" 3 => "Análisis de PCR cuantitativa" ] ] ] "en" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Keywords" "identificador" => "xpalclavsec548327" "palabras" => array:4 [ 0 => "Emphysema" 1 => "Recombinant human keratinocyte growth factor" 2 => "Akt pathway" 3 => "Quantitative PCR analysis" ] ] ] ] "tieneResumen" => true "resumen" => array:2 [ "es" => array:3 [ "titulo" => "Resumen" "resumen" => "IntroducciónEl enfisema se ha asociado a una disminución de la expresión de VEGF y VEGFR-2 y a la presencia de un número elevado de células alveolares apoptósicas. El factor de crecimiento queratinocítico estimula la síntesis de VEGF, lo cual proporciona, a su vez, un mantenimiento de la estructura pulmonar normal a través de la vía de Akt. En este estudio hemos investigado el posible papel del rHuKGF en la mejora de la falta de regulación de la vía de supervivencia celular mediada por Akt en ratones enfisematosos. MétodosSe establecieron 3 grupos experimentales: grupos de enfisema, tratamiento y control. Los pulmones de los ratones se trataron terapéuticamente en 3 ocasiones mediante la instilación orofaríngea de 10mg de rHuKGF/kg de peso corporal tras la inducción del enfisema mediante elastasa pancreática porcina. Posteriormente, se obtuvo tejido pulmonar de los ratones para la realización de exámenes de histopatología y biología molecular. Resultados y discusiónLas microfotografías de histopatología y el análisis del índice de destrucción han mostrado que el agrandamiento del espacio aéreo inducido por la elastasa y la pérdida de alvéolos se recuperaron en el grupo de tratamiento. El rHuKGF estimula la producción de VEGF, que a su vez induce la vía de supervivencia celular mediada por Akt en los pulmones enfisematosos. Se produjo un aumento significativo de la expresión de mRNA de VEGF, VEGFR, PI3K y Akt, mientras que hubo una disminución notable de Pten, caspasa-9 y Bad en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de enfisema, y los resultados fueron comparables a los del grupo de control. Además, la expresión de VEGF a nivel proteico concordaba con la observada a nivel de mRNA. ConclusiónLos suplementos terapéuticos de rHuKGF mejoran la mala regulación de la vía de Akt en el trastorno del enfisema, dando lugar a una supervivencia celular alveolar a través de una activación de la vía de la supervivencia celular dependiente de VEGF endógena. Así pues, el rHuKGF podría ser un posible fármaco para el tratamiento del enfisema." "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0005" "titulo" => "Introducción" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0010" "titulo" => "Métodos" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0015" "titulo" => "Resultados y discusión" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0020" "titulo" => "Conclusión" ] ] ] "en" => array:3 [ "titulo" => "Abstract" "resumen" => "IntroductionEmphysema has been associated with decreased VEGF and VEGFR-2 expression and the presence of high numbers of apoptotic alveolar cells. Keratinocyte growth factor stimulates VEGF synthesis which in turn confers normal lung structure maintenance via the Akt pathway. In this study the potential role of rHuKGF in the improvement of deregulated Akt mediated cell survival pathway in emphysematous mice was investigated. MethodsThree experimental groups, i.e., emphysema, treatment and control groups, were prepared. Lungs of mice were treated on 3 occasions by oropharyngeal instillation of 10mg rHuKGF per kg body weight after induction of emphysema with porcine pancreatic elastase. Subsequently, lung tissues from mice were collected for histopathology and molecular biology studies. Results and discussionHistopathology photomicrographs and destructive index analysis have shown that elastase-induced airspace enlargement and loss of alveoli recovered in the treatment group. rHuKGF stimulates VEGF production which in turn induces the Akt mediated cell survival pathway in emphysematous lungs. mRNA expression of VEGF, VEGFR, PI3K and Akt was significantly increased while Pten, Caspase-9 and Bad was notably decreased in treatment group when compared with emphysema group, being comparable with the control group. Moreover, VEGF protein expression was in accordance with that found for mRNA. ConclusionTherapeutic rHuKGF supplementation improves the deregulated Akt pathway in emphysema, resulting in alveolar cell survival through activation of the endogenous VEGF-dependent cell survival pathway. Hence rHuKGF may prove to be a potential drug in the treatment of emphysema." "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0025" "titulo" => "Introduction" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0030" "titulo" => "Methods" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0035" "titulo" => "Results and discussion" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0040" "titulo" => "Conclusion" ] ] ] ] "multimedia" => array:7 [ 0 => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figura 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 1780 "Ancho" => 2664 "Tamanyo" => 399483 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Hipótesis sobre el mecanismo de la inducción por el rHuKGF de la señalización de supervivencia mediada por Akt en el enfisema. El enfisema inducido por elastasa reduce los niveles de VEGF y de VEGFR2, con lo que modifica la señalización de supervivencia a través de PI-3K/Akt. Los factores de crecimiento (como VEGF, KGF etc.) y los factores de supervivencia activan receptores que reclutan PI3K hacia la membrana, lo cual activa a su vez la cinasa Akt. El antagonista Pten inhibe la supervivencia celular mediante una regulación negativa (que se indican con una flecha hacia abajo) de la vía de Akt a través de la desfosforilización. El Akt fosforila y compromete la función de las proteínas caspasa-9 y Bad, que intervienen en las vías de la muerte celular. Esta hipótesis corresponde a la desregulación de la supervivencia celular mediada por Akt en el grupo de enfisema inducido por elastasa (X). Se sabe que diversas moléculas, entre las que se encuentran varios factores de crecimiento, desempeñan un papel clave en la reparación y desarrollo del pulmón y en la supervivencia celular. En este caso, se cree que el suplemento de rHuKGF (S) induce la vía de supervivencia celular mediada por Akt en el enfisema y debe ser idéntico al grupo sano (Z). Akt: cepa de ratón Ak; Bad: promotor de muerte asociado a Bcl-2; PI3K: fosfatidilinosítido-3′-OH cinasa; Pten: homólogo de fosfatasa y tensina en cromosoma 10; t: timoma; VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular; VEGFR2: receptor de VEGF." ] ] 1 => array:7 [ "identificador" => "fig0010" "etiqueta" => "Figura 2" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr2.jpeg" "Alto" => 1663 "Ancho" => 2469 "Tamanyo" => 203690 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Representación esquemática del diseño experimental. El día 0 y el día 10, los ratones recibieron una instilación orofaríngea de 40μl de solución salina, con o sin elastasa pancreática porcina (2,5mg/kg de peso corporal). Los días 31, 34 y 37, los animales recibieron una instilación orofaríngea de 40μl de solución salina o de rHuKGF (10mg/kg de peso corporal). El día 40, los animales fueron sacrificados y se extrajeron los pulmones para los análisis de histopatología y de biología molecular. EK: elastasa-rHuKGF (grupo de tratamiento); ES: elastasa-solución salina (grupo de enfisema); rHuKGF: factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante; SS: solución salina (grupo sano)." ] ] 2 => array:7 [ "identificador" => "fig0015" "etiqueta" => "Figura 3" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr3.jpeg" "Alto" => 2844 "Ancho" => 2222 "Tamanyo" => 448686 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "(3-I). Histopatología del área de intercambio de gases. Cortes de tejido con tinción de hematoxilina y eosina que muestran (A) una histología normal en los pulmones de control, (B) una rarefacción de los tabiques alveolares con espacios aéreos agrandados en los pulmones con enfisema y (C) un aumento de los espacios aéreos con engrosamiento de los tabiques alveolares en los pulmones tratados. Todas las microfotografías se tomaron con unos aumentos idénticos. Para la determinación del índice de destrucción, se coloca una lámina transparente con 80 puntos distribuidos por igual sobre la imagen digitalizada impresa de un corte con tinción de HE (D, E, F). Para cada punto, se determina el área circundante según los criterios mencionados en el apartado de Métodos. EK: elastasa-rHuKGF (grupo de tratamiento); ES: elastasa-solución salina (grupo de enfisema); rHuKGF: factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante; SS: solución salina (grupo sano). (3-II). Análisis estadístico del índice de destrucción. A diferencia de lo observado en los pulmones sanos (SS), hubo un aumento significativo del índice de destrucción porcentual en el caso de los pulmones enfisematosos (ES), mientras que este se redujo con el suplemento de rHuKGF en los pulmones enfisematosos (EK). Los gráficos indican los valores de media con desviación estándar. Los datos se analizaron mediante la prueba de t para datos no emparejados, con objeto de evaluar el efecto del rHuKGF y la elastasa, respectivamente (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>-II). EK: elastasa-rHuKGF (grupo de tratamiento); ES: elastasa-solución salina (grupo de enfisema); rHuKGF: factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante; SS: solución salina (grupo sano). ***p ≤ 0,001 y **p ≤ 0,01 frente al correspondiente grupo de control." ] ] 3 => array:7 [ "identificador" => "fig0020" "etiqueta" => "Figura 4" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr4.jpeg" "Alto" => 3648 "Ancho" => 2597 "Tamanyo" => 312664 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "(4-I). Expresión relativa del mRNA de VEGF, VEGFR2, PI3K y Akt (A-D) en tejido pulmonar completo. Los niveles de VEGF, VEGFR2, PI3K y Akt presentaron una regulación negativa significativa en el grupo de enfisema (ES) en comparación con el grupo de control (SS). En cambio, los niveles de VEGF, VEGFR2, PI3K y Akt presentaron una regulación positiva significativa en el grupo de tratamiento (EK) y fueron comparables a los del grupo de control. Se determinaron los niveles de mRNA de los genes diana con los valores relativos respecto al gen de referencia endógeno de la actina β, según la fórmula de 2 elevado a la potencia de delta del umbral de ciclo (2ΔCt), en donde ΔCt=Ct, gen de referencia–Ct, gen diana. Akt: cepa de ratón Ak; EK: elastasa-rHuKGF (grupo de tratamiento); ES: elastasa-solución salina (grupo de enfisema); PI3K: fosfatidilinosítido-3′-OH cinasa; rHuKGF: factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante; SS: solución salina (grupo sano); VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular; VEGFR2: receptor de VEGF. *p<0,05 y **p<0,01 frente al respectivo grupo de control. (4-II). Análisis de densitometría de western blot de VEGF. La densitometría de western blot de VEGF puso de manifiesto un patrón similar al observado a nivel del mRNA (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>-IA). Los gráficos indican los valores de media con desviación estándar. Los datos se analizaron mediante la prueba de t para datos no emparejados, con objeto de evaluar el efecto del rHuKGF y la elastasa, respectivamente. Akt: cepa de ratón Ak; EK: elastasa-rHuKGF (grupo de tratamiento); ES: elastasa-solución salina (grupo de enfisema); PI3K: fosfatidilinosítido-3′-OH cinasa; rHuKGF: factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante; SS: solución salina (grupo sano); VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular; VEGFR2: receptor de VEGF. **p<0,01 frente al respectivo grupo de control." ] ] 4 => array:7 [ "identificador" => "fig0025" "etiqueta" => "Figura 5" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr5.jpeg" "Alto" => 1187 "Ancho" => 1616 "Tamanyo" => 49983 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Expresión relativa del mRNA del antagonista (Pten) de la vía de Akt en el tejido pulmonar completo. El nivel de expresión de Pten mostró una inducción significativa en los pulmones expuestos a elastasa, a diferencia del grupo de tratamiento. En el grupo de tratamiento hubo una disminución significativa de los niveles de expresión de Pten, con unos resultados comparables a los del grupo de control. Los niveles de mRNA de los genes diana se determinaron con los valores relativos respecto al gen de referencia endógeno de la actina β según la fórmula de 2 elevado a la potencia de delta del umbral de ciclo (2ΔCt), en donde ΔCt=Ct, gen de referencia–Ct, gen diana. Los gráficos indican los valores de media con desviación estándar. Los datos se analizaron mediante la prueba de t para datos no emparejados, con objeto de evaluar el efecto del rHuKGF y la elastasa, respectivamente. EK: elastasa- rHuKGF (grupo de tratamiento); ES: elastasa-solución salina (grupo de enfisema); rHuKGF: factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante; SS: solución salina (grupo sano); VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular. *p<0,05 y **p ≤ 0,01 frente al respectivo grupo de control." ] ] 5 => array:7 [ "identificador" => "fig0030" "etiqueta" => "Figura 6" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr6.jpeg" "Alto" => 940 "Ancho" => 2224 "Tamanyo" => 99896 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Expresión relativa de mRNA de marcadores de apoptosis (caspasa-9 y Bad) en el tejido pulmonar completo. El nivel de expresión de caspasa-9 y Bad mostró una inducción significativa en los pulmones expuestos a elastasa, a diferencia del grupo de tratamiento. En el grupo de tratamiento hubo una disminución significativa de los niveles de caspasa-9 y Bad, con unos niveles de expresión comparables a los del grupo de control. Los niveles de mRNA de los genes diana se determinaron con los valores relativos respecto al gen de referencia endógeno de la actina β según la fórmula de 2 elevado a la potencia de delta del umbral de ciclo (2ΔCt), en donde ΔCt=Ct, gen de referencia–Ct, gen diana. Los gráficos indican los valores de media con desviación estándar. Los datos se analizaron mediante la prueba de t para datos no emparejados, con objeto de evaluar el efecto del rHuKGF y la elastasa, respectivamente. 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Original

El factor de crecimiento queratinocítico humano recombinante induce la progresión de la supervivencia celular mediada por Akt en ratones enfisematosos

Recombinant Human Keratinocyte Growth Factor Induces Akt Mediated Cell Survival Progression in Emphysematous Mice

Jai Prakash Muyala,

Corresponding author

jmuyal@gbu.ac.in
suds.biotech@gmail.com

Autor para correspondencia.

, Dhananjay Kumara, Sudhir Kotnalaa, Vandana Muyalb,c, Amit Kumar Tyagid

a Department of Biotechnology, School of Biotechnology, Gautam Buddha University, Greater Noida, Uttar Pradesh, India

b Department of Internal Medicine, Division of Respiratory Medicine, Philipps-Universität Marburg, Marburg, Alemania

c 14/Type V, Gautam Buddha University, Greater Noida, Uttar Pradesh, India

d Division of Nuclear Medicine, Institute of Nuclear Medicine and Allied Sciences, Defense Research Development Organization, Nueva Delhi, India

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que contribuye a limitar el flujo a&#233;reo y se cree que es irreversible<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0010"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46; Hasta el momento no disponemos de ning&#250;n tratamiento eficaz para restablecer un par&#233;nquima pulmonar con un intercambio de gases normal despu&#233;s de que se hayan establecido las alteraciones enfisematosas&#46; Aunque se ha descrito un papel prometedor del tratamiento con &#225;cido all-trans-retinoico en modelos del enfisema en roedores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0015"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>&#44; no hay ning&#250;n tratamiento de eficacia cl&#237;nica probada que fomente la recuperaci&#243;n del enfisema establecido<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0020"><span class="elsevierStyleSup">4&#44;5</span></a>&#46; As&#237; pues&#44; la inducci&#243;n de una regeneraci&#243;n alveolar contin&#250;a siendo un importante reto para el desarrollo de nuevos tratamientos para el enfisema<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0030"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a>&#46;</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El factor de crecimiento queratinoc&#237;tico &#40;KGF&#41; es un mit&#243;geno potente en diferentes tipos de c&#233;lulas epiteliales y facilita la reparaci&#243;n de la piel&#44; la c&#243;rnea y el recubrimiento gastrointestinal mediante la estimulaci&#243;n de la divisi&#243;n y crecimiento de las c&#233;lulas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0035"><span class="elsevierStyleSup">7&#8211;9</span></a>&#46; Esta reparaci&#243;n epitelial ha motivado un inter&#233;s por su posible uso para el tratamiento de la lesi&#243;n epitelial en la lesi&#243;n pulmonar aguda<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#46; El KGF modula varios mecanismos que se ha observado que son importantes en la reparaci&#243;n del epitelio alveolar y&#44; por tanto&#44; ha generado un inter&#233;s como posible intervenci&#243;n terap&#233;utica en la lesi&#243;n pulmonar aguda&#46; El primer estudio sobre el efecto protector del KGF ex&#243;geno en un modelo en roedores con lesi&#243;n pulmonar aguda fue el presentado por Panos et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a>&#46; Los autores indicaron que la administraci&#243;n intratraqueal de KGF humano recombinante &#40;rHuKGF&#41; estimulaba la proliferaci&#243;n de las c&#233;lulas de tipo 2 del epitelio alveolar in vivo y reduc&#237;a la lesi&#243;n pulmonar inducida por la hiperoxia en las ratas&#46; Posteriormente&#44; el KGF ex&#243;geno se ha explorado ampliamente con fines de protecci&#243;n del pulm&#243;n frente a la lesi&#243;n pulmonar experimental&#44; como la inducida por bleomicina<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">12&#44;13</span></a>&#44; neumon&#237;a por <span class="elsevierStyleItalic">Pseudomonas aeruginosa</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>&#44; &#225;cido clorh&#237;drico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0075"><span class="elsevierStyleSup">15&#44;16</span></a>&#44; &#225;cido oleico<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> o radiaci&#243;n y bleomicina<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46; Recientemente&#44; los datos de un modelo de perfusi&#243;n pulmonar humano ex vivo de la lesi&#243;n pulmonar inducida por endotoxina han indicado que el tratamiento con KGF mejora la funci&#243;n de barrera epitelial y endotelial pulmonar&#44; y mejora la tasa de eliminaci&#243;n del l&#237;quido alveolar&#44; con lo que reduce el edema alveolar<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0095"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a>&#46; Tiene inter&#233;s se&#241;alar que los suplementos de rHuKGF aplicados a pulmones enfisematosos muestran una regeneraci&#243;n pulmonar del epitelio alveolar y el endotelio capilar&#44; as&#237; como una transformaci&#243;n y mantenimiento del tejido intersticial<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>&#46; Adem&#225;s&#44; el KGF tiene tendencia a estimular la producci&#243;n de factor de crecimiento endotelial vascular &#40;VEGF&#41; en los queratinocitos humanos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0105"><span class="elsevierStyleSup">21&#8211;23</span></a>&#46; El VEGF es un mit&#243;geno espec&#237;fico de las c&#233;lulas endoteliales y participa en la reparaci&#243;n de las heridas&#44; la angiog&#233;nesis&#44; la permeabilidad microvascular y la protecci&#243;n vascular&#46; Sin embargo&#44; su expresi&#243;n en la producci&#243;n de c&#233;lulas est&#225; estrictamente regulada por factores de crecimiento<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0110"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46; En condiciones normales&#44; estos factores de crecimiento no estimulan de manera directa la angiog&#233;nesis&#44; pero pueden modularla a trav&#233;s de la modulaci&#243;n de la expresi&#243;n de VEGF en tipos celulares espec&#237;ficos&#44; ejerciendo por tanto un efecto angiog&#233;nico o antiangiog&#233;nico indirecto<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46; Entre estos factores de crecimiento&#44; el factor de crecimiento fibrobl&#225;stico 4<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a>&#44; el KGF<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>&#44; el PDGF<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0135"><span class="elsevierStyleSup">27</span></a> y el factor de crecimiento transformador &#946;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0140"><span class="elsevierStyleSup">28</span></a> son los que pueden potenciar la producci&#243;n de VEGF&#44; que a su vez activa la v&#237;a de fosfatidilinos&#237;tido-3&#8217;-OH cinasa &#40;PI3K&#41;-Akt<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">29</span></a>&#46; En especial en el pulm&#243;n&#44; la v&#237;a de PI3K-Akt regula m&#250;ltiples procesos celulares&#44; incluida la proliferaci&#243;n&#44; supervivencia&#44; crecimiento y motilidad de las c&#233;lulas alveolares<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">30&#44;31</span></a>&#46; As&#237; pues&#44; en el presente estudio&#44; investigamos el posible papel del suplemento ex&#243;geno de KGF en la inducci&#243;n de la supervivencia celular mediada por Akt&#44; mediante la activaci&#243;n de PI3K y sus dianas distales en el enfisema &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Material y m&#233;todos</span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Preparaci&#243;n de los modelos animales</span><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Todos los experimentos realizados en animales se llevaron a cabo atendiendo a lo establecido en las gu&#237;as institucionales que compilaban las regulaciones nacionales e internacionales&#44; y han sido aprobados por el gobierno regional &#40;IAEC&#44; Ministerio de Medio Ambiente y Silvicultura&#44; India&#41;&#46; Todos los modelos animales experimentales se prepararon seg&#250;n lo descrito por Yildirim et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>&#46; Se utilizaron ratones machos C57BL de 8 semanas y libres de pat&#243;genos&#44; con un peso corporal de unos 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>g&#44; que fueron asignados aleatoriamente a 3 modelos experimentales diferentes&#46; Se mantuvo a los ratones bajo anestesia de isoflurano y se les administr&#243; o bien elastasa o bien rHuKGF&#47;soluci&#243;n salina mediante instilaci&#243;n orofar&#237;ngea&#46; Los detalles del desarrollo de los modelos experimentales se describen en el texto que sigue y en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005"><span class="elsevierStyleLabel">&#8211;</span><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Modelo de control &#40;soluci&#243;n salina<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>soluci&#243;n salina &#91;SS&#93;&#59; n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>8&#41;</span>&#58; La instilaci&#243;n orofar&#237;ngea se utiliz&#243; para administrar 40<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de soluci&#243;n salina los d&#237;as 1&#44; 10&#44; 31&#44; 34 y 37&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010"><span class="elsevierStyleLabel">&#8211;</span><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Modelo de enfisema &#40;elastasa<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>soluci&#243;n salina &#91;ES&#93;&#59; n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>8&#41;</span>&#58; Se indujo un enfisema mediante la instilaci&#243;n orofar&#237;ngea de elastasa pancre&#225;tica porcina &#40;2&#44;25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg&#47;kg de peso corporal&#41; en los pulmones de ratones los d&#237;as 1 y 10&#46; Sin embargo&#44; los pulmones tratados con elastasa recibieron soluci&#243;n salina el d&#237;a 31&#44; 34 y 37&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015"><span class="elsevierStyleLabel">&#8211;</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">Modelo terap&#233;utico del enfisema &#40;elastasa<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rHuKGF &#91;EK&#93;&#59; n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>8&#41;</span>&#58; A los pulmones tratados con elastasa se les aplicaron 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg&#47;kg de peso corporal de rHuKGF mediante instilaci&#243;n orofar&#237;ngea los d&#237;as 31&#44; 34 y 37&#46;</p></li></ul></p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el d&#237;a 40&#44; los animales fueron sacrificados con el m&#233;todo de luxaci&#243;n cervical&#46; Se ventilaron los pulmones artificialmente y se perfundieron con soluci&#243;n salina tamponada con fosfato est&#233;ril&#44; para la extracci&#243;n de la sangre&#46; Se utiliz&#243; el pulm&#243;n derecho para los an&#225;lisis de histopatolog&#237;a&#44; mientras que los tejidos del pulm&#243;n izquierdo se sumergieron de inmediato en un tanque de nitr&#243;geno l&#237;quido y se conservaron a &#8722;80<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C hasta el momento del an&#225;lisis para los estudios de biolog&#237;a molecular&#46;</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Fijaci&#243;n del pulm&#243;n</span><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los pulmones derechos se fijaron mediante instilaci&#243;n en la v&#237;a a&#233;rea de paraformaldeh&#237;do tamponado con fosfato al 6&#37; a una presi&#243;n de 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>cm de columna de l&#237;quido y se conservaron una noche en el refrigerador&#46; La deshidrataci&#243;n&#44; limpieza e infiltraci&#243;n se realizaron con el empleo de protocolos est&#225;ndares&#46; Los cortes de tejido procesados se colocaron en un bloque de parafina y se dejaron enfriar y solidificar antes de realizar los cortes de tejido&#46; A continuaci&#243;n se elimin&#243; la parafina del tejido 3 veces mediante Xylene y se volvi&#243; a hidratar con diferentes concentraciones de etanol&#46; Con el empleo de un microtomo &#40;microtomo rotatorio&#44; Spencers&#44; India&#41;&#44; se realizaron cortes de tejido finos&#44; de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#46; Los cortes de tejido finos se ti&#241;eron con hematoxilina y eosina &#40;H&#38;E&#41;&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Morfometr&#237;a</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Destrucci&#243;n del par&#233;nquima&#58; Se utiliz&#243; una t&#233;cnica de recuento de puntos microsc&#243;picos para determinar el grado de destrucci&#243;n del par&#233;nquima&#44; en lo que se denomina un an&#225;lisis de &#237;ndice de destrucci&#243;n &#40;DI&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">32</span></a>&#46; Se coloc&#243; una l&#225;mina transparente con 83 puntos de recuento sobre una impresi&#243;n en tama&#241;o A4 de las im&#225;genes microsc&#243;picas procedentes de los cortes te&#241;idos&#46; Para cada pieza pulmonar se utiliz&#243; la media de 3 cortes diferentes&#44; y se seleccionaron en los cortes generalmente 3 campos no solapados representativos&#46; La evaluaci&#243;n de la presencia de destrucci&#243;n se llev&#243; a cabo mediante el recuento de los puntos de solapamiento de espacios alveolares y ductales&#44; seg&#250;n lo descrito por Robbesom et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">33</span></a>&#46; Se calcul&#243; el porcentaje del total de puntos incluidos en las diversas categor&#237;as de espacios a&#233;reos destruidos&#44; para obtener el DI&#44; utilizando la f&#243;rmula &#91;D&#47;&#40;D<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>N&#41;&#93;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>x<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>100&#37;&#44; en donde D<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>destruidos y N<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>normales&#46; Se calcularon las diferencias de DI en los grupos de enfisema y de tratamiento respecto al grupo de control &#40;100&#37;&#41;&#46;</p></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Aislamiento del ARN total del pulm&#243;n izquierdo y s&#237;ntesis de cDNA</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para investigar la expresi&#243;n relativa del mRNA en el tejido pulmonar&#44; se extrajo el ARN total con el empleo de una t&#233;cnica basada en el RNeasy Mini Kit &#40;Qiagen&#44; Nueva Delhi&#44; India&#41; con una peque&#241;a modificaci&#243;n del protocolo de Muyal et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">34</span></a>&#46; Se determin&#243; la cantidad y la pureza del ARN total con Nanodrop &#40;Thermo Scientific&#44; EE&#46; UU&#46;&#41; mientras que la calidad de la integridad del ARN total se evalu&#243; analizando el ARN ribos&#243;mico 18S y 28S en una electroforesis en gel de agarosa te&#241;ida con bromuro de etidio al 1&#44;2&#37;&#46; Se sintetiz&#243; el cDNA de primera hebra mediante la introducci&#243;n de cantidades iguales de ARN &#40;300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ng&#41; de cada muestra en un volumen de reacci&#243;n total de 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l con el empleo de un cebador Oligo dt &#40;Qiagen&#44; Nueva Delhi&#44; India&#41; y un Omniscript RT Kit &#40;Qiagen&#44; Nueva Delhi&#44; India&#41; y los respectivos protocolos&#46; La reacci&#243;n se incub&#243; a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h en Thermoblock TB2 &#40;Biometra&#44; Goettingen&#44; Alemania&#41;&#46;</p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Cuantificaci&#243;n de mRNA relativa</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se realiz&#243; una PCR en tiempo real para determinar el factor de amplificaci&#243;n de los genes diana &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>&#41; en un formato de 96 pocillos de Stratagene Mx 3005P &#40;Agilent Technologies&#44; Inc&#46;&#44; EE&#46; UU&#46;&#41; en un volumen de reacci&#243;n total de 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l&#44; utilizando 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de un QuantiTect SYBR Green PCR Kit &#40;Qiagen&#44; Nueva Delhi&#44; India&#41;&#44; 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de cada cebador oligonucle&#243;tido directo e inverso con especificidad de secuencia &#40;10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>pmol&#41;&#44; 7<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de agua y 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de cDNA&#46; Las condiciones de los ciclos t&#233;rmicos utilizadas en todas las reacciones fueron las siguientes&#58; paso 1&#58; 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#59; 30 ciclos de paso 2 &#40;95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 45<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s&#41;&#59; paso 3 &#40;temperatura de templado del cebador oligonucle&#243;tido de secuencia espec&#237;fica&#59; v&#233;ase la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> para los 35<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s&#41;&#59; y paso 4 &#40;72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 45<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s&#41;&#44; seguido de un tiempo de paso 5&#58; 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Aislamiento de prote&#237;nas y western blot para factor de crecimiento endotelial vascular</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se extrajo la prote&#237;na total de 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de WLT con el empleo de un kit de extracci&#243;n de prote&#237;na total &#40;Biochem Life Sciences&#44; Nueva Delhi&#44; India&#41;&#46; El protocolo para western blot de VEGF se ha llevado a cabo seg&#250;n lo descrito por Yildirim et al&#46; para el western blot de VEGFR2<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">An&#225;lisis estad&#237;stico de la cuantificaci&#243;n de mRNA relativa</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se determinaron los niveles de genes diana de mRNA relativos al control end&#243;geno de actina &#946;&#44; seg&#250;n la f&#243;rmula de 2 elevado a la potencia de delta del umbral de ciclo &#40;2<span class="elsevierStyleSup">&#916;Ct</span>&#41;&#44; en donde &#916;Ct<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Ct&#44; gen de referencia&#8211;Ct&#44; gen de estudio&#46; Se evalu&#243; la significaci&#243;n estad&#237;stica de las diferencias entre los grupos experimentales con el empleo de una prueba de Mann-Whitney no param&#233;trica &#40;GraphPad Prism versi&#243;n 4&#44; San Diego&#44; EE&#46; UU&#46;&#41;&#46; Los niveles de significaci&#243;n se indican mediante &#42;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;05&#59; &#42;&#42;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;01&#46;</p></span></span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Resultados</span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Efectos del factor de crecimiento queratinoc&#237;tico humano recombinante sobre la arquitectura tisular</span><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La instilaci&#243;n orofar&#237;ngea de 2&#44;25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de elastasa pancre&#225;tica porcina &#47;kg de peso corporal en 2 ocasiones &#40;d&#237;as 0&#44; 10&#41; produjo un enfisema pulmonar grave&#44; tal como se muestra en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">figura 3-I-B</a> de una microfotograf&#237;a obtenida en el estudio histopatol&#243;gico&#46; Sin embargo&#44; la microfotograf&#237;a de los pulmones enfisematosos tratados con rHuKGF mostr&#243; de manera evidente la recuperaci&#243;n de los tabiques alveolares perdidos en el grupo de tratamiento &#40;EK&#44; <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3-I-C</a>&#41; y fue comparable al grupo de control &#40;SS&#44; <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3-I-A</a>&#41;&#46; En la determinaci&#243;n del DI de los cortes de tejido de los 3 modelos animales &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3-I-D&#44; E y F</a>&#41;&#44; el modelo de ratones enfisematosos mostr&#243; unos valores de DI significativamente superiores a los del modelo de control &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;001&#41;&#46; Sin embargo&#44; el DI se redujo significativamente &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;001&#41; en el caso de los modelos de tratamiento&#44; es decir&#44; los pulmones enfisematosos de ratones tratados con rHuKGF &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3-II</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Efectos del factor de crecimiento queratinoc&#237;tico humano recombinante sobre el factor de crecimiento endotelial vascular&#44; receptor de factor de crecimiento endotelial vascular&#44; fosfatidilinos&#237;tido-3&#8217;-OH cinasa y Akt</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En un estado normal&#44; la uni&#243;n de VEGF al VEGFR2 activa la cascada de se&#241;alizaci&#243;n de Akt distal&#44; lo cual interviene&#44; a su vez&#44; en la supervivencia de las c&#233;lulas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>&#41;&#46; Para determinar si el suplemento de rHuKGF induce la cascada de se&#241;alizaci&#243;n de Akt en los pulmones enfisematosos&#44; evaluamos los niveles de expresi&#243;n de mRNA de VEGF&#44; VEGFR 2&#44; PI3K y Akt respectivamente&#46; En contraste con los pulmones enfisematosos&#44; el grupo de tratamiento &#40;EK&#41; muestra la inducci&#243;n favorable de los niveles de mRNA de VEGF &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;05&#41;&#44; VEGFR2 &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;03&#41;&#44; PI3K &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;001&#41; y Akt &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;02&#41;&#44; respectivamente&#46; Sin embargo&#44; la expresi&#243;n de estos genes estaba notablemente reducida en los pulmones enfisematosos &#40;ES&#41; en comparaci&#243;n con los sanos &#40;SS&#41; &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig&#46; 4-I</a>&#41;&#46; Adem&#225;s&#44; en la validaci&#243;n de la expresi&#243;n de VEGF a nivel de prote&#237;na&#44; el an&#225;lisis de western blot para el VEGF muestra un patr&#243;n similar al observado a nivel de mRNA &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig&#46; 4-II</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0085" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Efectos del factor de crecimiento queratinoc&#237;tico humano recombinante sobre el antagonista para la v&#237;a de Akt</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se ha descrito que el Pten es un regulador negativo de la v&#237;a de supervivencia celular de Akt&#46; Su sobreexpresi&#243;n da lugar a una desregulaci&#243;n de la se&#241;alizaci&#243;n de la supervivencia celular&#46; Nuestros datos muestran una regulaci&#243;n positiva significativa de la expresi&#243;n del mRNA del Pten &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;04&#41; en los pulmones enfisematosos &#40;ES&#41; en comparaci&#243;n con los sanos &#40;SS&#41;&#46; El papel beneficioso del rHuKGF en los pulmones enfisematosos se apreci&#243; tambi&#233;n en una reducci&#243;n significativa del nivel de mRNA de Pten &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;008&#41; en comparaci&#243;n con el grupo de ES&#44; y es importante se&#241;alar que fue comparable a lo observado en los pulmones sanos &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig&#46; 5</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0025"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0090" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Efectos del factor de crecimiento queratinoc&#237;tico humano recombinante sobre los marcadores de apoptosis</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para que se produzca una p&#233;rdida de unidades alveolares&#44; ser&#237;a de prever que&#44; incluso en el modelo de enfisema con elastasa pancre&#225;tica porcina&#44; hubiera tambi&#233;n una cierta apoptosis de las c&#233;lulas alveolares&#46; Para evaluar la apoptosis en nuestros modelos animales experimentales&#44; se estudi&#243; la expresi&#243;n de mRNA de marcadores de la apoptosis&#44; es decir caspasa-9 y Bad&#44; en la v&#237;a Akt&#46; En este caso&#44; los niveles normalizados de mRNA de caspasa-9 &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;01&#41; y Bad &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;01&#41; en el tejido pulmonar enfisematoso &#40;ES&#41; mostraron una regulaci&#243;n positiva significativa en comparaci&#243;n con los pulmones sanos &#40;SS&#41;&#46; Sin embargo&#44; se observ&#243; un efecto prometedor del rHuKGF en el estado de enfisema &#40;EK&#41;&#46; En el grupo de tratamiento &#40;EK&#41;&#44; observamos una reducci&#243;n de los niveles de expresi&#243;n de caspasa-9 &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;02&#41; y Bad &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;0007&#41; en comparaci&#243;n con los pulmones enfisematosos &#40;ES&#41;&#44; lo cual indica que el rHuKGF tiene una tendencia a contrarrestar la apoptosis de las c&#233;lulas alveolares &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0030">fig&#46; 6</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0030"></elsevierMultimedia></span></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0135">Discusi&#243;n</span><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La patogenia del enfisema pulmonar no se conoce por completo&#44; aunque se han propuesto varios mecanismos&#44; como un desequilibrio de proteasas y antiproteasas&#44; inflamaci&#243;n cr&#243;nica y estr&#233;s oxidativo&#46; Adem&#225;s de estos mecanismos&#44; estudios recientes muestran otro mecanismo involucrado en el desarrollo del enfisema pulmonar que se basa en un aumento de las c&#233;lulas endoteliales y epiteliales alveolares apopt&#243;sicas en los pulmones<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175"><span class="elsevierStyleSup">35</span></a>&#46; Sin embargo&#44; la formaci&#243;n del enfisema pulmonar puede interpretarse tambi&#233;n como la consecuencia de un fallo de los procesos de reparaci&#243;n del pulm&#243;n&#46; En la actualidad&#44; no disponemos de ninguna opci&#243;n terap&#233;utica que permita la reparaci&#243;n de los alv&#233;olos perdidos en el estado enfisematoso&#46; As&#237; pues&#44; la inducci&#243;n de una regeneraci&#243;n alveolar contin&#250;a siendo un importante reto para el desarrollo de nuevos tratamientos para el enfisema&#46; Tan solo recientemente&#44; la administraci&#243;n de KGF ha mostrado ser el factor de crecimiento potente que posee propiedades tanto protectoras como curativas en el estado de enfisema<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">20&#44;36</span></a>&#46; Sin embargo&#44; los mecanismos moleculares distales que rigen la supervivencia de las c&#233;lulas alveolares no se han abordado por el momento&#46; As&#237; pues&#44; en el presente estudio&#44; hemos intentado mostrar el posible efecto del rHuKGF en la activaci&#243;n de la cascada de se&#241;alizaci&#243;n de Akt&#44; mediante la estimulaci&#243;n de la producci&#243;n de VEGF en ratones enfisematosos&#46;</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Nuestros resultados muestran claramente un posible papel del rHuKGF en los pulmones de ratones enfisematosos&#46; El papel prospectivo del rHuKGF se observ&#243; claramente en la arquitectura tisular con el empleo de histopatolog&#237;a del an&#225;lisis del DI basado en morfometr&#237;a&#46; Las microfotograf&#237;as mostraron la p&#233;rdida de los tabiques alveolares en los pulmones enfisematosos en comparaci&#243;n con los pulmones sanos&#46; Se observ&#243; que esta p&#233;rdida de los tabiques alveolares se recuperaba en el grupo de tratamiento y era del todo comparable a la de los grupos sanos&#46; Yildirim et al&#46; han descrito una observaci&#243;n similar&#44; con el empleo de la longitud de intersecci&#243;n media como instrumento para cuantificar el da&#241;o y la recuperaci&#243;n del tejido alveolar<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>&#46; En nuestro estudio utilizamos un an&#225;lisis basado en el DI como instrumento para cuantificar tanto el da&#241;o como la recuperaci&#243;n del tejido alveolar&#44; con objeto de abordar el papel prospectivo del rHuKGF&#46; El valor medio de DI de los pulmones enfisematosos es superior al valor de los pulmones sanos&#46; Robbesom et al&#46; observaron tambi&#233;n un valor de DI similar en los grandes fumadores en comparaci&#243;n con los controles<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">33</span></a>&#46; Creemos que los valores m&#225;s altos de DI pueden deberse a las condiciones de medida estrictas de nuestro estudio&#44; lo cual descarta posibles sesgos como un tejido con insuflaci&#243;n sub&#243;ptima&#46; Tiene inter&#233;s se&#241;alar que los valores de DI se redujeron de manera significativa con el suplemento de rHuKGF en los pulmones enfisematosos&#46; Este efecto rec&#237;proco en los valores de DI puede deberse a una regeneraci&#243;n de las paredes de los tabiques alveolares&#44; que dio lugar a un aumento del n&#250;mero de espacios alveolares intactos&#46; Aparte del papel prospectivo del rHuKGF sobre la arquitectura tisular&#44; a continuaci&#243;n&#44; se investig&#243; el papel prospectivo del rHuKGF en la cascada de se&#241;alizaci&#243;n de Akt en los pulmones de ratones enfisematosos en el presente trabajo&#46;</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Seg&#250;n lo indicado por Shiojima et al&#46;&#44; la uni&#243;n del VEGF al VEGFR2 activa la cascada de se&#241;alizaci&#243;n de Akt&#44; lo cual es importante en la supervivencia&#44; proliferaci&#243;n y migraci&#243;n celulares y en la angiog&#233;nesis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185"><span class="elsevierStyleSup">37</span></a>&#46; Adem&#225;s&#44; el KGF tiene una posible tendencia a inducir la activaci&#243;n del Akt&#44; lo cual puede ser el mecanismo com&#250;n subyacente en la citoprotecci&#243;n de las c&#233;lulas epiteliales de diferentes tejidos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">38&#44;39</span></a>&#46; En el pulm&#243;n&#44; Ray et al&#46; obtuvieron unos resultados similares&#44; y se&#241;alaron que el KGF estimula la secreci&#243;n de VEGF&#44; lo cual potencia la citoprotecci&#243;n de las c&#233;lulas endoteliales mediante la activaci&#243;n de Akt<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">40&#44;41&#44;29</span></a>&#46; En este estudio se observ&#243; que con el suplemento de rHuKGF en los pulmones enfisematosos&#44; los niveles de mRNA de los genes candidatos &#40;VEGF&#44; VEGFR2&#44; PI3K y Akt&#41;&#44; involucrados en la cascada de se&#241;alizaci&#243;n de Akt&#44; tienen una regulaci&#243;n positiva hasta el nivel &#243;ptimo&#44; igual que se observa en los pulmones sanos&#46; Adem&#225;s&#44; la expresi&#243;n de prote&#237;na del VEGF sufri&#243; una inducci&#243;n significativa en los pulmones enfisematosos tratados con rHuKGF&#46; Esto sugiere que el rHuKGF tiene el potencial de establecer una arquitectura pulmonar normal&#44; tras la p&#233;rdida de los tejidos alveolares&#44; mediante la estimulaci&#243;n de la expresi&#243;n de VEGF en los pulmones enfisematosos&#46; Anteriormente se ha descrito que&#44; en los pulmones enfisematosos de pacientes fumadores y pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva cr&#243;nica&#44; la expresi&#243;n de mRNA y de prote&#237;na de VEGF y VEGFR2 presentaron una regulaci&#243;n negativa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">42</span></a>&#46; Esta reducci&#243;n de la expresi&#243;n de VEGF&#47;VEGFR puede conducir a una apoptosis de las c&#233;lulas endoteliales con los consiguientes cambios enfisematosos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0220"><span class="elsevierStyleSup">43&#8211;46</span></a>&#46;</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Adem&#225;s&#44; los pulmones enfisematosos a los que se aplica un suplemento de KGF muestran una inducci&#243;n en los niveles de mRNA de PI-3K&#44; que estaban reducidos en esos pulmones&#46; Esta inducci&#243;n de PI-3K mejora la interacci&#243;n de VEGFR2 con PI-3K para la activaci&#243;n de la cascada de se&#241;alizaci&#243;n distal&#44; con lo que se mantiene la viabilidad celular<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240"><span class="elsevierStyleSup">47</span></a>&#46; Adem&#225;s&#44; el efecto favorable del rHuKGF se observ&#243; tambi&#233;n a nivel del mRNA de Akt&#46; Se observ&#243; que la expresi&#243;n que estaba reducida en el grupo de enfisema aumentaba tras los suplementos de rHuKGF en los pulmones enfisematosos&#46; Esta inducci&#243;n en la expresi&#243;n de Akt puede tener m&#250;ltiples efectos beneficiosos sobre los procesos celulares&#44; en especial en cuanto a la proliferaci&#243;n y supervivencia de las c&#233;lulas alveolares&#46; La inducci&#243;n de la actividad de la Akt cinasa producida por el KGF de un modo dependiente de la dosis y del tiempo ha sido comentada tambi&#233;n por Shenying et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">48</span></a>&#46; Sus resultados concluyeron que el KGF tiene la m&#225;xima eficacia en el mantenimiento de la viabilidad celular mediante la estimulaci&#243;n de la actividad de la Akt cinasa antes de la exposici&#243;n a los est&#237;mulos inductores de apoptosis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">48</span></a>&#46;</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Nosotros observamos tambi&#233;n que el rHuKGF tiene el potencial de reducir al m&#237;nimo la sobreexpresi&#243;n de Pten y caspasa-9 a un nivel &#243;ptimo en los pulmones enfisematosos&#46; El Pten act&#250;a como un antagonista de la supervivencia celular mediante la regulaci&#243;n negativa de la v&#237;a de Akt a trav&#233;s de la desfosforilizaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250"><span class="elsevierStyleSup">49</span></a> y por tanto la inhibici&#243;n del fosfatidilinositol 3&#44; 4&#44; 5-trifosfato &#40;PI &#91;3&#44; 4&#44; 5&#93; P3&#41;&#46; Se ha descrito que la sobreexpresi&#243;n de Pten en el epitelio alveolar causa una notable reducci&#243;n de la proliferaci&#243;n celular&#44; un aumento notable de la apoptosis y una diferenciaci&#243;n funcional incompleta&#44; lo cual comporta una regulaci&#243;n negativa de la v&#237;a de la supervivencia celular<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">50</span></a>&#46; De igual modo&#44; se ha observado que el aumento de la expresi&#243;n de la caspasa-9 interviene en la apoptosis celular y la disminuci&#243;n de la supervivencia celular<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">51</span></a>&#46; En este estudio&#44; los niveles de mRNA de Pten y caspasa-9 en los pulmones enfisematosos tratados con suplementos de rHuKGF presentaron una regulaci&#243;n negativa&#44; a diferencia de lo observado en los pulmones enfisematosos&#46; Estos cambios favorables podr&#237;an deberse a una supresi&#243;n de la sobreexpresi&#243;n de Pten y caspasa-9<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">48</span></a> y a una inducci&#243;n de la activaci&#243;n de Akt que favorece la disminuci&#243;n de la apoptosis de las c&#233;lulas alveolares y el aumento de la supervivencia celular&#46;</p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El Bad proapopt&#243;sico es la diana principal de Akt y el Akt fosforila el Bad&#44; con lo que lo hace inactivo para la se&#241;al de apoptosis<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0265"><span class="elsevierStyleSup">52&#44;53</span></a>&#46; Datta et al&#46; plantearon la hip&#243;tesis de que la v&#237;a de PI3K-Akt puede conducir a una fosforilaci&#243;n del Bad y puede inhibir por tanto la muerte celular y promover la supervivencia de las c&#233;lulas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">54&#44;55</span></a>&#46; En especial en el estado de enfisema Hu et al&#46; mostraron un aumento de la expresi&#243;n de Bad en las c&#233;lulas de m&#250;sculo liso de v&#237;as a&#233;reas humanas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0285"><span class="elsevierStyleSup">56</span></a>&#46; En nuestro estudio se observ&#243; que la expresi&#243;n de Bad estaba regulada positivamente en los pulmones enfisematosos en comparaci&#243;n con los sanos&#44; lo cual podr&#237;a deberse al fallo de la fosforilizaci&#243;n del Bad por el Akt&#46; Sin embargo&#44; el posible efecto del rHuKGF sobre el Bad se evalu&#243; con mayor detalle en los pulmones enfisematosos&#46; La expresi&#243;n del Bas mostr&#243; una notable regulaci&#243;n negativa en el grupo de tratamiento en comparaci&#243;n con los pulmones enfisematosos y fue id&#233;ntica a la de los pulmones sanos&#46; Estos resultados respaldan nuevamente los posibles efectos favorables del suplemento de rHuKGF en un programa de supervivencia y mantenimiento celulares&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los datos generados por este estudio muestran claramente que el rHuKGF puede ser una medicina molecular potente&#44; que pueda inducir el VEGF end&#243;geno y producir se&#241;ales de supervivencia importantes que son necesarias para el mantenimiento de la estructura normal del pulm&#243;n&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0140">Conclusi&#243;n</span><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los resultados de este trabajo ponen de manifiesto la eficacia terap&#233;utica del rHuKGF para rectificar la v&#237;a de supervivencia celular dependiente de Akt que est&#225; desregulada en el estado de enfisema&#46; Los efectos favorables se apreciaron en la arquitectura del tejido y en su an&#225;lisis cuantitativo&#46; Adem&#225;s&#44; los genes que se asocian a la v&#237;a de la supervivencia celular dependiente de Akt que regulan la supervivencia de las c&#233;lulas alveolares se expresaron de manera constructiva con los suplementos de rHuKGF ex&#243;geno en los pulmones enfisematosos&#46; Considerados conjuntamente&#44; los resultados indican que el mantenimiento de la supervivencia celular en el grupo de tratamiento fue inducido por la mejora de la v&#237;a de supervivencia celular dependiente de Akt&#59; y plantean la posibilidad de tratar a los pacientes con enfisema&#46; No obstante&#44; deber&#225;n realizarse estudios m&#225;s detallados&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0145">Contribuciones espec&#237;ficas de cada autor</span><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Jai Prakash Muyal particip&#243; en el dise&#241;o del estudio y llev&#243; a cabo la preparaci&#243;n del modelo animal&#44; el an&#225;lisis estad&#237;stico y supervis&#243; el trabajo y colabor&#243; en la elaboraci&#243;n de la versi&#243;n preliminar del manuscrito&#46; Dhananjay Kumar llev&#243; a cabo el aislamiento del ARN de los tejidos pulmonares&#44; la s&#237;ntesis de cDNA y la PCR cuantitativa&#46; Sudhir Kotnala realiz&#243; la histopatolog&#237;a&#44; el an&#225;lisis del &#237;ndice de destrucci&#243;n y el western blot&#46; Vandana Muyal particip&#243; en el western blot y en la preparaci&#243;n del manuscrito&#46; Amit K&#46; Tyagi colabor&#243; en la preparaci&#243;n de los diferentes modelos animales&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0150">Conflicto de intereses</span><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener conflictos de intereses directa ni indirectamente relacionados con el contenido del manuscrito&#46;</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Nombre del gen&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Cebador izquierdo &#91;5&#8217;-3&#8217;&#93;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Cebador derecho &#91;5&#8217;-3&#8217;&#93;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Longitud de amplic&#243;n &#40;pb&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">VEGFA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">CAGGCTGCTGTAACGATGAA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">GCATTCACATCTGCTGTGCT&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">140&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">VEGFR2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">ACCAAGGCGACTATGTTTGC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">GGGCAAGTCACTTCAATGGT&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">160&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">PI3K&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">CAAAGCGGAGAACCTATTGC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">CCGGTGGCAGTCTTGTTAAT&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">138&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Akt1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">GTGAAAGAGAAGGCCACAGG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">GTCGTGGGTCTGGAATGAGT&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">165&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Pten&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">AGACCATAACCCACCACAGC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">TACACCAGTCCGTCCCTTTC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">127&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Caspasa-9&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">GATGCTGTCCCCTATCAGGA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">CGATGTACCAGGAGCCACTT&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">151&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Bad&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">GGAGCTTAGCCCTTTTCGAG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">GCTTTGTCGCATCTGTGTTG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">166&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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Article information

ISSN: 03002896
Original language: Spanish

DOI:10.1016/j.arbres.2014.04.019

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