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Los fragmentos de tejido obtenidos son peque&#241;os y&#44; por lo tanto&#44; rinden un escaso n&#250;mero de CEB&#46; Para solucionar la dificultad de obtener un n&#250;mero suficiente de c&#233;lulas requeridas en experimentos m&#225;s complejos&#44; se han desarrollado l&#237;neas comerciales de CEB&#46; Estas c&#233;lulas no siempre proporcionan el genotipo de la enfermedad en estudio<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El objetivo del presente estudio ha sido desarrollar un m&#233;todo que incrementase la producci&#243;n de CEB humanas en cultivo primario&#46; Este m&#233;todo permitir&#237;a realizar estudios complejos repetidos a partir de explantes de muestras de un mismo paciente procedentes de broncoscopia o cirug&#237;a tor&#225;cica&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Material y m&#233;todos</span></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Obtenci&#243;n de muestras</span></p><p class="elsevierStylePara">Se incluyeron muestras de pacientes sometidos a resecci&#243;n quir&#250;rgica o bien a broncoscopia seg&#250;n el manejo habitual de sus enfermedades siguiendo los protocolos estandarizados&#46; Se inform&#243; acerca del tipo de intervenci&#243;n realizada a todos los pacientes&#44; que firmaron su consentimiento&#46; El estudio fue aprobado por el Comit&#233; de &#201;tica del hospital&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Cirug&#237;a tor&#225;cica</span></p><p class="elsevierStylePara">Se incluyeron muestras de 9 pacientes que se sometieron a cirug&#237;a tor&#225;cica resectiva por tumoraci&#243;n&#46; De la pieza quir&#250;rgica extirpada se seleccion&#243; y seccion&#243; un peque&#241;o fragmento no afectado&#44; situado en el extremo m&#225;s distal de la zona patol&#243;gica&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Broncoscopia</span></p><p class="elsevierStylePara">Se incluy&#243; a 3 pacientes a los que se practic&#243; una broncoscopia&#46; Con ayuda de una pinza para broncoscopio se realiz&#243; una biopsia por paciente en la carina principal considerando que esta zona no presentara aspecto patol&#243;gico&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Cultivos celulares</span></p><p class="elsevierStylePara">La composici&#243;n del medio y las concentraciones finales se prepararon seg&#250;n Devalia et al<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#46; El medio de cultivo 199 con L-glutamina se suplement&#243; con 2&#44;5 &#956;g&#47;ml de insulina&#44; 0&#44;361 &#956;g&#47;ml de hidrocortisona y 2&#44;5 &#956;g&#47;ml de apo-transferrina &#40;Sigma Chemical Co&#46;&#44; St&#46; Louis&#44; MO&#44; EE&#46;UU&#41;&#44; un 2&#44;5&#37; de Nu-serum IV y 20 ng&#47;ml de factor de crecimiento epid&#233;rmico &#40;Becton Dickinson&#44; Bedford&#44; MA&#44; EE&#46;UU&#46;&#41;&#44; un 1&#37; de penicilina-estreptomicina &#40;Life Technologies&#44; Gibco BRL&#44; Grand Island&#44; NY&#44; EE&#46;UU&#46;&#41; y 2 &#956;g&#47;ml de anfotericina B &#40;Squibb Industria Farmac&#233;utica S&#46;A&#46;&#44; Esplugues de Llobregat&#44; Barcelona&#44; Espa&#241;a&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Obtenci&#243;n de c&#233;lulas epiteliales</span></p><p class="elsevierStylePara">De la pieza procedente de quir&#243;fano se obtuvo el m&#225;ximo n&#250;mero de explantes raspando la cara interna del bronquio con ayuda de unas pinzas y un bistur&#237;&#46; Las biopsias endosc&#243;picas se dividieron en fracciones o explantes&#46; Todos los explantes midieron de 1 a 2 mm&#46; Se lavaron con suero fisiol&#243;gico&#44; cloruro s&#243;dico al 0&#44;9&#37;&#44; con un 1&#37; de penicilina- estreptomicina&#44; y se colocaron en placas previamente tratadas con col&#225;geno tipo I &#40;Sigma Chemical Co&#46;&#44; St&#46; Louis&#44; MO&#44; EE&#46;UU&#46;&#41; para estimular su proliferaci&#243;n&#46; Se a&#241;adi&#243; una gota de medio 199 suplementado sobre cada explante despu&#233;s de asegurarse de su adhesi&#243;n a la placa&#46; La placa se incub&#243; a 37 &#186;C&#44; con un 5&#37; de di&#243;xido de carbono y un 90&#37; de humedad&#44; y no se movi&#243; durante 3 d&#237;as para evitar que se despegaran los explantes&#46; Transcurrido este tiempo&#44; se reemplaz&#243; el medio por 3 ml de medio nuevo por placa&#46; En d&#237;as alternos se sigui&#243; la proliferaci&#243;n celular bajo lupa y se cambi&#243; el medio de cultivo&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Subcultivo de explantes</span></p><p class="elsevierStylePara">Los explantes se subcultivaron en otra placa&#44; a los 10 d&#237;as&#44; cuando se observ&#243; un radio de proliferaci&#243;n celular moderado a su alrededor&#46; Se retiraron los explantes de tejido y se transfirieron a otra placa recubierta de col&#225;geno respetando el resto de CEB&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Disgregaci&#243;n enzim&#225;tica</span></p><p class="elsevierStylePara"> Cuando las c&#233;lulas recubr&#237;an m&#225;s de la mitad de la superficie de crecimiento&#44; a las 3 semanas&#44; se disgregaron enzim&#225;ticamente&#46; Se extrajo el medio de las placas y se lavaron con suero fisiol&#243;gico est&#233;ril&#44; con un 1&#37; de penicilina-estreptomicina&#46; Se a&#241;adieron 2 ml de la soluci&#243;n tripsina-EDTA &#40;Biological Industries&#44; Beit Haemek Kibbutz&#44; Israel&#41; por placa y se incubaron a 37 &#186;C durante 5 min&#46; Para inhibir la acci&#243;n de la tripsina&#44; se a&#241;adieron 2 ml de suero fetal bovino &#40;Biological Industries&#44; Beit Haemek Kibbutz&#44; Israel&#41; y se centrifug&#243; a 345 g durante 5 min&#46; Se prepararon extensiones en duplicado para realizar la t&#233;cnica immunocitoqu&#237;mica&#46; El resto se resuspendi&#243; en 2 ml de suero fisiol&#243;gico est&#233;ril al 0&#44;9&#37; con un 1&#37; de penicilina-estreptomicina&#46; El recuento celular y la viabilidad se valoraron en 10 &#956;l de esta suspensi&#243;n con la utilizaci&#243;n del colorante de exclusi&#243;n azul de tr&#237;pano al 0&#44;4&#37; &#40;Sigma Chemical Co&#46;&#44; St Louis&#44; MO&#44; EE&#46;UU&#46;&#41; y la c&#225;mara de Neubauer&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Tinci&#243;n inmunocitoqu&#237;mica para citoqueratina 7</span></p><p class="elsevierStylePara">Se utilizaron el anticuerpo primario monoclonal de rat&#243;n anticitoqueratina 7 humana y el anticuerpo secundario de cabra antiinmunoglobulina G de rat&#243;n marcado con peroxidasa&#46; La reacci&#243;n qu&#237;mica se realiz&#243; con el substrato 3&#44;3&#39;-diaminobenzidina para peroxidasa y se ti&#241;&#243; con hematoxilina de Harris para contrastar&#46; El material para inmunocitoqu&#237;mica se obtuvo de DAKO corporation &#40;Carpinteria&#44; CA&#44; EE&#46;UU&#46;&#41;&#46; Se calcul&#243; el porcentaje de c&#233;lulas positivas para anticitoqueratina 7&#46; Paralelamente&#44; se realiz&#243; un bloque de parafina con epitelio bronquial sano y se ti&#241;&#243; por inmunohistoqu&#237;mica para calcular el porcentaje de c&#233;lulas epiteliales postivas para citoqueratina 7&#46; El control negativo para citoqueratina 7 fueron cultivos con fibroblastos&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> An&#225;lisis estad&#237;stico</span></p><p class="elsevierStylePara">En el an&#225;lisis estad&#237;stico se utiliz&#243; el paquete inform&#225;tico Statistical Package for the Social Sciencies &#40;SPSS&#174;&#41; versi&#243;n 10&#46;0 &#40;1999&#41;&#46; Se obtuvieron los valores medios para cada variable y su desviaci&#243;n est&#225;ndar&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold"> Resultados</span></p><p class="elsevierStylePara">Se obtuvo un total de 12 muestras&#58; 9 procedentes de cirug&#237;a tor&#225;cica y 3 de broncoscopia&#46; Del total de casos&#44; hab&#237;a 11 varones y 1 mujer&#44; y la edad media &#40;&#177; desviaci&#243;n est&#225;ndar&#41; era de 65 &#177; 12 a&#241;os&#46; Todos los sujetos eran fumadores o ex fumadores&#44; con un volumen espiratorio forzado en el primer segundo medio del 70 &#177; 13&#37; de su valor te&#243;rico&#44; y 5 de ellos hab&#237;an recibido quimioterapia&#46; Los resultados&#44; caso por caso&#44; se describen en la tabla I&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="6v41n09-13078655tab01.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">La media de explantes fue de 18&#44;1 &#177; 14&#44;0 procedentes de muestras obtenidas por resecci&#243;n quir&#250;rgica y de 6 &#177; 1&#44;2 procedentes de biopsia bronquial por broncoscopia&#46; Los explantes de las muestras cultivadas se subcultivaron una media de 3&#44;4 veces &#40;entre 2 y 5 subcultivos&#41;&#46; Los fragmentos procedentes de resecci&#243;n quir&#250;rgica dieron mejores resultados que los procedentes de broncoscopia&#46; En la tabla II se describen las medias por cada subcultivo&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="6v41n09-13078655tab02.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">La media en millones de CEB obtenidas despu&#233;s del procedimiento fue de 2&#44;42 &#177; 4&#44;08 &#40;3&#44;18 &#177; 4&#44;5 en muestras de resecci&#243;n quir&#250;rgica y 0&#44;15 &#177; 2&#44;2 en muestras de biopsia bronquial&#41;&#46; La media del porcentaje de amplificaci&#243;n del n&#250;mero de CEB obtenidas de los cultivos primarios fue del 300 &#177; 143&#37; &#40;del 343&#37; para los casos de biopsia bronquial y del 200&#37; para los de resecci&#243;n quir&#250;rgica&#41;&#46; En el total de CEB se observ&#243; una viabilidad media del 91&#44;9 &#177; 11&#44;7&#37;&#58; del 92&#44;1 &#177; 10&#44;3&#37; en los casos de resecci&#243;n quir&#250;rgica y del 90&#44;47 &#177; 18&#44;9&#37; en los de biopsia bronquial&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El rendimiento&#44; definido como la obtenci&#243;n de un elevado n&#250;mero de CEB con alta viabilidad&#44; vari&#243; durante los subcultivos&#44; de modo que fue superior en los subcultivos iniciales&#44; para disminuir a medida que el explante envejec&#237;a&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La t&#233;cnica de inmunocitoqu&#237;mica mostr&#243; una media del 30&#44;7 &#177; 10&#44;68&#37; de c&#233;lulas positivas para citoqueratina 7&#46; La media del control positivo fue del 59&#44;2&#37;&#46; Los subcultivos finales mostraron tendencia a incrementar ligeramente el n&#250;mero de c&#233;lulas no positivas para citoqueratina 7&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold"> Discusi&#243;n</span></p><p class="elsevierStylePara"> Aunque la t&#233;cnica de cultivo ha sido expuesta previamente<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#44; &#233;sta es la primera vez que se utiliza para amplificar el n&#250;mero de CEB y&#44; adem&#225;s&#44; se describe de manera detallada&#46; Esta amplificaci&#243;n permitir&#237;a realizar experimentos de mayor magnitud&#44; adem&#225;s de incrementar el n&#250;mero de ensayos para cada una de las muestras&#44; ya que el n&#250;mero de CEB obtenidas de los cultivos primarios es&#44; de media&#44; 3 veces mayor a las conseguidas de un simple cultivo&#46; El mayor incremento de CEB se da en subcultivos iniciales y es menos acentuado en los finales&#46; Aunque la viabilidad no var&#237;a a lo largo del proceso&#44; hay una disminuci&#243;n en cuanto a la calidad de las c&#233;lulas&#44; reflejada en el descenso de la positividad para citoqueratina 7&#46; Parece ser que las CEB procedentes de cirug&#237;a tor&#225;cica y broncoscopia se comportar&#237;an igual en este aspecto&#46; No ha sido as&#237; en cuanto al n&#250;mero de subcultivos&#46; Una explicaci&#243;n a este fen&#243;meno ser&#237;a la escasez de muestra&#44; que ha limitado el n&#250;mero de explantes cultivados&#46; En este estudio&#44; los resultados de las muestras procedentes de broncoscopia y cirug&#237;a son algo distintos&#44; por lo que quiz&#225; no deber&#237;an mezclarse&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> Existen diferentes protocolos&#44; ya descritos en la bibliograf&#237;a&#44; para cultivar CEB&#58; cultivo de &#243;rganos&#44; cultivo de explantes y cultivo de c&#233;lulas disociadas&#46; En el cultivo de &#243;rganos&#44; las CEB est&#225;n acompa&#241;adas de otros tipos celulares no epiteliales como fibroblastos&#44; c&#233;lulas endoteliales&#44; inflamatorias y musculares&#44; que podr&#237;an interferir en algunos experimentos<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; Varios autores prefieren disgregar enzim&#225;ticamente el tejido para aislar las CEB<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46; La disgregaci&#243;n enzim&#225;tica podr&#237;a causar cambios bioqu&#237;micos y morfol&#243;gicos en las c&#233;lulas que les impidieran diferenciarse y madurar correctamente hasta la forma final ciliada<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Las CEB requieren un sustrato para permitir la adhesi&#243;n celular al ser cultivadas&#46; De las distintas t&#233;cnicas de recubrimiento descritas en la bibliograf&#237;a&#44; en este estudio se ha utilizado el col&#225;geno con el fin de incrementar la proliferaci&#243;n de CEB<span class="elsevierStyleSup">5</span>&#46; Existe controversia sobre la adici&#243;n o no de suero al medio de cultivo&#46; Jorissen et al<span class="elsevierStyleSup">4</span> observan que concentraciones elevadas de suero &#40;10-20&#37;&#41; inhiben el crecimiento e inducen la diferenciaci&#243;n escamosa&#44; pero la utilizaci&#243;n de derivados s&#233;ricos como NU-serum o Ultroser G permite el cultivo con &#233;xito de c&#233;lulas epiteliales nasales&#46; La tinci&#243;n inmunocitoqu&#237;mica con anticitoqueratina 7 es una t&#233;cnica de gran utilidad para caracterizar el origen celular de los cultivos&#46; El epitelio traqueal humano normal expresa dicho polip&#233;ptido&#44; que se ha estudiado en patolog&#237;a para discriminar entre tumores primarios y metast&#225;sicos en el pulm&#243;n<span class="elsevierStyleSup">6</span>&#46; Tambi&#233;n se ha descrito <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> para caracterizar c&#233;lulas epiteliales glandulares de cultivos y demostrar que las CEB pueden mantener una caracter&#237;sticas morfol&#243;gicas y bioqu&#237;micas similares a las encontradas <span class="elsevierStyleItalic">in vivo</span><span class="elsevierStyleSup">7</span>&#46; En ese mismo estudio&#44; el 39&#44;8 &#177; 0&#44;95&#37; de las CEB cultivadas eran de tipo glandular&#44; mientras que en nuestro estudio obtenemos una media del 30&#44;71 &#177; 10&#44;68&#37;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">En conclusi&#243;n&#44; el m&#233;todo desarrollado en este estudio permite incrementar 3 veces como media el n&#250;mero de CEB humanas obtenidas en cultivos primarios&#46; Este m&#233;todo posibilita la realizaci&#243;n de estudios complejos y repetidos en los que se precise una mayor cantidad celular a partir de explantes de muestras de un mismo paciente obtenidas por broncoscopio y&#47;o resecci&#243;n quir&#250;rgica&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold"> Agradecimientos</span></p><p class="elsevierStylePara">Los autores quieren expresar su gratitud al Dr&#46; R&#46;J&#46; Sapsford por proporcionar detalles sobre m&#233;todos de cultivo y a los compa&#241;eros de Cirug&#237;a Tor&#225;cica y Broncoscopia del Departamento de Neumolog&#237;a del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau por aportar las muestras estudiadas&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> Este estudio ha sido subvencionado en parte por Red-Respira-ISCIII-RTIC-03&#47;11&#46;</p>"
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Método para amplificar cultivos primarios de células epiteliales bronquiales
Expansion of Primary Epithelial Cell Cultures
G. Margarita, J. Beldaa, P. Casana, J. Sanchisa
a Departamento de Neumología. Hospital de la Santa Creu i de Sant Pau. Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona. Barcelona. España.
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Los fragmentos de tejido obtenidos son peque&#241;os y&#44; por lo tanto&#44; rinden un escaso n&#250;mero de CEB&#46; Para solucionar la dificultad de obtener un n&#250;mero suficiente de c&#233;lulas requeridas en experimentos m&#225;s complejos&#44; se han desarrollado l&#237;neas comerciales de CEB&#46; Estas c&#233;lulas no siempre proporcionan el genotipo de la enfermedad en estudio<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El objetivo del presente estudio ha sido desarrollar un m&#233;todo que incrementase la producci&#243;n de CEB humanas en cultivo primario&#46; Este m&#233;todo permitir&#237;a realizar estudios complejos repetidos a partir de explantes de muestras de un mismo paciente procedentes de broncoscopia o cirug&#237;a tor&#225;cica&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Material y m&#233;todos</span></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Obtenci&#243;n de muestras</span></p><p class="elsevierStylePara">Se incluyeron muestras de pacientes sometidos a resecci&#243;n quir&#250;rgica o bien a broncoscopia seg&#250;n el manejo habitual de sus enfermedades siguiendo los protocolos estandarizados&#46; Se inform&#243; acerca del tipo de intervenci&#243;n realizada a todos los pacientes&#44; que firmaron su consentimiento&#46; El estudio fue aprobado por el Comit&#233; de &#201;tica del hospital&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Cirug&#237;a tor&#225;cica</span></p><p class="elsevierStylePara">Se incluyeron muestras de 9 pacientes que se sometieron a cirug&#237;a tor&#225;cica resectiva por tumoraci&#243;n&#46; De la pieza quir&#250;rgica extirpada se seleccion&#243; y seccion&#243; un peque&#241;o fragmento no afectado&#44; situado en el extremo m&#225;s distal de la zona patol&#243;gica&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Broncoscopia</span></p><p class="elsevierStylePara">Se incluy&#243; a 3 pacientes a los que se practic&#243; una broncoscopia&#46; Con ayuda de una pinza para broncoscopio se realiz&#243; una biopsia por paciente en la carina principal considerando que esta zona no presentara aspecto patol&#243;gico&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Cultivos celulares</span></p><p class="elsevierStylePara">La composici&#243;n del medio y las concentraciones finales se prepararon seg&#250;n Devalia et al<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#46; El medio de cultivo 199 con L-glutamina se suplement&#243; con 2&#44;5 &#956;g&#47;ml de insulina&#44; 0&#44;361 &#956;g&#47;ml de hidrocortisona y 2&#44;5 &#956;g&#47;ml de apo-transferrina &#40;Sigma Chemical Co&#46;&#44; St&#46; Louis&#44; MO&#44; EE&#46;UU&#41;&#44; un 2&#44;5&#37; de Nu-serum IV y 20 ng&#47;ml de factor de crecimiento epid&#233;rmico &#40;Becton Dickinson&#44; Bedford&#44; MA&#44; EE&#46;UU&#46;&#41;&#44; un 1&#37; de penicilina-estreptomicina &#40;Life Technologies&#44; Gibco BRL&#44; Grand Island&#44; NY&#44; EE&#46;UU&#46;&#41; y 2 &#956;g&#47;ml de anfotericina B &#40;Squibb Industria Farmac&#233;utica S&#46;A&#46;&#44; Esplugues de Llobregat&#44; Barcelona&#44; Espa&#241;a&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Obtenci&#243;n de c&#233;lulas epiteliales</span></p><p class="elsevierStylePara">De la pieza procedente de quir&#243;fano se obtuvo el m&#225;ximo n&#250;mero de explantes raspando la cara interna del bronquio con ayuda de unas pinzas y un bistur&#237;&#46; Las biopsias endosc&#243;picas se dividieron en fracciones o explantes&#46; Todos los explantes midieron de 1 a 2 mm&#46; Se lavaron con suero fisiol&#243;gico&#44; cloruro s&#243;dico al 0&#44;9&#37;&#44; con un 1&#37; de penicilina- estreptomicina&#44; y se colocaron en placas previamente tratadas con col&#225;geno tipo I &#40;Sigma Chemical Co&#46;&#44; St&#46; Louis&#44; MO&#44; EE&#46;UU&#46;&#41; para estimular su proliferaci&#243;n&#46; Se a&#241;adi&#243; una gota de medio 199 suplementado sobre cada explante despu&#233;s de asegurarse de su adhesi&#243;n a la placa&#46; La placa se incub&#243; a 37 &#186;C&#44; con un 5&#37; de di&#243;xido de carbono y un 90&#37; de humedad&#44; y no se movi&#243; durante 3 d&#237;as para evitar que se despegaran los explantes&#46; Transcurrido este tiempo&#44; se reemplaz&#243; el medio por 3 ml de medio nuevo por placa&#46; En d&#237;as alternos se sigui&#243; la proliferaci&#243;n celular bajo lupa y se cambi&#243; el medio de cultivo&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Subcultivo de explantes</span></p><p class="elsevierStylePara">Los explantes se subcultivaron en otra placa&#44; a los 10 d&#237;as&#44; cuando se observ&#243; un radio de proliferaci&#243;n celular moderado a su alrededor&#46; Se retiraron los explantes de tejido y se transfirieron a otra placa recubierta de col&#225;geno respetando el resto de CEB&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Disgregaci&#243;n enzim&#225;tica</span></p><p class="elsevierStylePara"> Cuando las c&#233;lulas recubr&#237;an m&#225;s de la mitad de la superficie de crecimiento&#44; a las 3 semanas&#44; se disgregaron enzim&#225;ticamente&#46; Se extrajo el medio de las placas y se lavaron con suero fisiol&#243;gico est&#233;ril&#44; con un 1&#37; de penicilina-estreptomicina&#46; Se a&#241;adieron 2 ml de la soluci&#243;n tripsina-EDTA &#40;Biological Industries&#44; Beit Haemek Kibbutz&#44; Israel&#41; por placa y se incubaron a 37 &#186;C durante 5 min&#46; Para inhibir la acci&#243;n de la tripsina&#44; se a&#241;adieron 2 ml de suero fetal bovino &#40;Biological Industries&#44; Beit Haemek Kibbutz&#44; Israel&#41; y se centrifug&#243; a 345 g durante 5 min&#46; Se prepararon extensiones en duplicado para realizar la t&#233;cnica immunocitoqu&#237;mica&#46; El resto se resuspendi&#243; en 2 ml de suero fisiol&#243;gico est&#233;ril al 0&#44;9&#37; con un 1&#37; de penicilina-estreptomicina&#46; El recuento celular y la viabilidad se valoraron en 10 &#956;l de esta suspensi&#243;n con la utilizaci&#243;n del colorante de exclusi&#243;n azul de tr&#237;pano al 0&#44;4&#37; &#40;Sigma Chemical Co&#46;&#44; St Louis&#44; MO&#44; EE&#46;UU&#46;&#41; y la c&#225;mara de Neubauer&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Tinci&#243;n inmunocitoqu&#237;mica para citoqueratina 7</span></p><p class="elsevierStylePara">Se utilizaron el anticuerpo primario monoclonal de rat&#243;n anticitoqueratina 7 humana y el anticuerpo secundario de cabra antiinmunoglobulina G de rat&#243;n marcado con peroxidasa&#46; La reacci&#243;n qu&#237;mica se realiz&#243; con el substrato 3&#44;3&#39;-diaminobenzidina para peroxidasa y se ti&#241;&#243; con hematoxilina de Harris para contrastar&#46; El material para inmunocitoqu&#237;mica se obtuvo de DAKO corporation &#40;Carpinteria&#44; CA&#44; EE&#46;UU&#46;&#41;&#46; Se calcul&#243; el porcentaje de c&#233;lulas positivas para anticitoqueratina 7&#46; Paralelamente&#44; se realiz&#243; un bloque de parafina con epitelio bronquial sano y se ti&#241;&#243; por inmunohistoqu&#237;mica para calcular el porcentaje de c&#233;lulas epiteliales postivas para citoqueratina 7&#46; El control negativo para citoqueratina 7 fueron cultivos con fibroblastos&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> An&#225;lisis estad&#237;stico</span></p><p class="elsevierStylePara">En el an&#225;lisis estad&#237;stico se utiliz&#243; el paquete inform&#225;tico Statistical Package for the Social Sciencies &#40;SPSS&#174;&#41; versi&#243;n 10&#46;0 &#40;1999&#41;&#46; Se obtuvieron los valores medios para cada variable y su desviaci&#243;n est&#225;ndar&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold"> Resultados</span></p><p class="elsevierStylePara">Se obtuvo un total de 12 muestras&#58; 9 procedentes de cirug&#237;a tor&#225;cica y 3 de broncoscopia&#46; Del total de casos&#44; hab&#237;a 11 varones y 1 mujer&#44; y la edad media &#40;&#177; desviaci&#243;n est&#225;ndar&#41; era de 65 &#177; 12 a&#241;os&#46; Todos los sujetos eran fumadores o ex fumadores&#44; con un volumen espiratorio forzado en el primer segundo medio del 70 &#177; 13&#37; de su valor te&#243;rico&#44; y 5 de ellos hab&#237;an recibido quimioterapia&#46; Los resultados&#44; caso por caso&#44; se describen en la tabla I&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="6v41n09-13078655tab01.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">La media de explantes fue de 18&#44;1 &#177; 14&#44;0 procedentes de muestras obtenidas por resecci&#243;n quir&#250;rgica y de 6 &#177; 1&#44;2 procedentes de biopsia bronquial por broncoscopia&#46; Los explantes de las muestras cultivadas se subcultivaron una media de 3&#44;4 veces &#40;entre 2 y 5 subcultivos&#41;&#46; Los fragmentos procedentes de resecci&#243;n quir&#250;rgica dieron mejores resultados que los procedentes de broncoscopia&#46; En la tabla II se describen las medias por cada subcultivo&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="6v41n09-13078655tab02.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">La media en millones de CEB obtenidas despu&#233;s del procedimiento fue de 2&#44;42 &#177; 4&#44;08 &#40;3&#44;18 &#177; 4&#44;5 en muestras de resecci&#243;n quir&#250;rgica y 0&#44;15 &#177; 2&#44;2 en muestras de biopsia bronquial&#41;&#46; La media del porcentaje de amplificaci&#243;n del n&#250;mero de CEB obtenidas de los cultivos primarios fue del 300 &#177; 143&#37; &#40;del 343&#37; para los casos de biopsia bronquial y del 200&#37; para los de resecci&#243;n quir&#250;rgica&#41;&#46; En el total de CEB se observ&#243; una viabilidad media del 91&#44;9 &#177; 11&#44;7&#37;&#58; del 92&#44;1 &#177; 10&#44;3&#37; en los casos de resecci&#243;n quir&#250;rgica y del 90&#44;47 &#177; 18&#44;9&#37; en los de biopsia bronquial&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El rendimiento&#44; definido como la obtenci&#243;n de un elevado n&#250;mero de CEB con alta viabilidad&#44; vari&#243; durante los subcultivos&#44; de modo que fue superior en los subcultivos iniciales&#44; para disminuir a medida que el explante envejec&#237;a&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La t&#233;cnica de inmunocitoqu&#237;mica mostr&#243; una media del 30&#44;7 &#177; 10&#44;68&#37; de c&#233;lulas positivas para citoqueratina 7&#46; La media del control positivo fue del 59&#44;2&#37;&#46; Los subcultivos finales mostraron tendencia a incrementar ligeramente el n&#250;mero de c&#233;lulas no positivas para citoqueratina 7&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold"> Discusi&#243;n</span></p><p class="elsevierStylePara"> Aunque la t&#233;cnica de cultivo ha sido expuesta previamente<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#44; &#233;sta es la primera vez que se utiliza para amplificar el n&#250;mero de CEB y&#44; adem&#225;s&#44; se describe de manera detallada&#46; Esta amplificaci&#243;n permitir&#237;a realizar experimentos de mayor magnitud&#44; adem&#225;s de incrementar el n&#250;mero de ensayos para cada una de las muestras&#44; ya que el n&#250;mero de CEB obtenidas de los cultivos primarios es&#44; de media&#44; 3 veces mayor a las conseguidas de un simple cultivo&#46; El mayor incremento de CEB se da en subcultivos iniciales y es menos acentuado en los finales&#46; Aunque la viabilidad no var&#237;a a lo largo del proceso&#44; hay una disminuci&#243;n en cuanto a la calidad de las c&#233;lulas&#44; reflejada en el descenso de la positividad para citoqueratina 7&#46; Parece ser que las CEB procedentes de cirug&#237;a tor&#225;cica y broncoscopia se comportar&#237;an igual en este aspecto&#46; No ha sido as&#237; en cuanto al n&#250;mero de subcultivos&#46; Una explicaci&#243;n a este fen&#243;meno ser&#237;a la escasez de muestra&#44; que ha limitado el n&#250;mero de explantes cultivados&#46; En este estudio&#44; los resultados de las muestras procedentes de broncoscopia y cirug&#237;a son algo distintos&#44; por lo que quiz&#225; no deber&#237;an mezclarse&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> Existen diferentes protocolos&#44; ya descritos en la bibliograf&#237;a&#44; para cultivar CEB&#58; cultivo de &#243;rganos&#44; cultivo de explantes y cultivo de c&#233;lulas disociadas&#46; En el cultivo de &#243;rganos&#44; las CEB est&#225;n acompa&#241;adas de otros tipos celulares no epiteliales como fibroblastos&#44; c&#233;lulas endoteliales&#44; inflamatorias y musculares&#44; que podr&#237;an interferir en algunos experimentos<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; Varios autores prefieren disgregar enzim&#225;ticamente el tejido para aislar las CEB<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46; La disgregaci&#243;n enzim&#225;tica podr&#237;a causar cambios bioqu&#237;micos y morfol&#243;gicos en las c&#233;lulas que les impidieran diferenciarse y madurar correctamente hasta la forma final ciliada<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Las CEB requieren un sustrato para permitir la adhesi&#243;n celular al ser cultivadas&#46; De las distintas t&#233;cnicas de recubrimiento descritas en la bibliograf&#237;a&#44; en este estudio se ha utilizado el col&#225;geno con el fin de incrementar la proliferaci&#243;n de CEB<span class="elsevierStyleSup">5</span>&#46; Existe controversia sobre la adici&#243;n o no de suero al medio de cultivo&#46; Jorissen et al<span class="elsevierStyleSup">4</span> observan que concentraciones elevadas de suero &#40;10-20&#37;&#41; inhiben el crecimiento e inducen la diferenciaci&#243;n escamosa&#44; pero la utilizaci&#243;n de derivados s&#233;ricos como NU-serum o Ultroser G permite el cultivo con &#233;xito de c&#233;lulas epiteliales nasales&#46; La tinci&#243;n inmunocitoqu&#237;mica con anticitoqueratina 7 es una t&#233;cnica de gran utilidad para caracterizar el origen celular de los cultivos&#46; El epitelio traqueal humano normal expresa dicho polip&#233;ptido&#44; que se ha estudiado en patolog&#237;a para discriminar entre tumores primarios y metast&#225;sicos en el pulm&#243;n<span class="elsevierStyleSup">6</span>&#46; Tambi&#233;n se ha descrito <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> para caracterizar c&#233;lulas epiteliales glandulares de cultivos y demostrar que las CEB pueden mantener una caracter&#237;sticas morfol&#243;gicas y bioqu&#237;micas similares a las encontradas <span class="elsevierStyleItalic">in vivo</span><span class="elsevierStyleSup">7</span>&#46; En ese mismo estudio&#44; el 39&#44;8 &#177; 0&#44;95&#37; de las CEB cultivadas eran de tipo glandular&#44; mientras que en nuestro estudio obtenemos una media del 30&#44;71 &#177; 10&#44;68&#37;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">En conclusi&#243;n&#44; el m&#233;todo desarrollado en este estudio permite incrementar 3 veces como media el n&#250;mero de CEB humanas obtenidas en cultivos primarios&#46; Este m&#233;todo posibilita la realizaci&#243;n de estudios complejos y repetidos en los que se precise una mayor cantidad celular a partir de explantes de muestras de un mismo paciente obtenidas por broncoscopio y&#47;o resecci&#243;n quir&#250;rgica&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold"> Agradecimientos</span></p><p class="elsevierStylePara">Los autores quieren expresar su gratitud al Dr&#46; R&#46;J&#46; Sapsford por proporcionar detalles sobre m&#233;todos de cultivo y a los compa&#241;eros de Cirug&#237;a Tor&#225;cica y Broncoscopia del Departamento de Neumolog&#237;a del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau por aportar las muestras estudiadas&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> Este estudio ha sido subvencionado en parte por Red-Respira-ISCIII-RTIC-03&#47;11&#46;</p>"
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Article information
ISSN: 03002896
Original language: Spanish
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2024 November 49 1 50
2024 October 307 17 324
2024 September 278 23 301
2024 August 181 23 204
2024 July 127 10 137
2024 June 203 15 218
2024 May 177 25 202
2024 April 160 22 182
2024 March 151 21 172
2024 February 102 28 130
2023 June 1 0 1
2023 March 37 2 39
2023 February 158 15 173
2023 January 129 20 149
2022 December 115 24 139
2022 November 255 31 286
2022 October 158 40 198
2022 September 205 64 269
2022 August 169 41 210
2022 July 186 39 225
2022 June 109 25 134
2022 May 125 34 159
2022 April 170 48 218
2022 March 152 35 187
2022 February 149 33 182
2022 January 165 36 201
2021 December 106 42 148
2021 November 132 51 183
2021 October 213 87 300
2021 September 135 52 187
2021 August 132 47 179
2021 July 96 30 126
2021 June 104 61 165
2021 May 115 35 150
2021 April 203 61 264
2021 March 162 35 197
2021 February 128 25 153
2021 January 93 41 134
2020 December 113 28 141
2020 November 148 20 168
2020 October 151 14 165
2020 September 114 21 135
2020 August 110 17 127
2020 July 83 24 107
2020 June 113 15 128
2020 May 183 27 210
2020 April 168 18 186
2020 March 134 16 150
2020 February 143 15 158
2020 January 94 11 105
2019 December 119 17 136
2019 November 123 9 132
2019 October 113 20 133
2019 September 142 8 150
2019 August 88 19 107
2019 July 78 10 88
2019 June 111 12 123
2019 May 150 39 189
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2019 March 154 22 176
2019 February 96 21 117
2019 January 104 38 142
2018 December 72 33 105
2018 November 130 21 151
2018 October 159 32 191
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